劉彩霞 喬增培 楊錦紅 李向陽

鮑曼不動(dòng)桿菌(acinetobacter baumannii，AB)作為條件致病菌，廣泛分布于自然界。近年來，因其在醫(yī)院內(nèi)感染中的分離率和泛耐藥菌株的迅速增多而引起廣泛關(guān)注。2007年Smith等［1］通過直接測序，運(yùn)用比較基因組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)，AB基因組中含有許多外來基因島，除了一些插入元件和耐藥基因外，還包括一些毒力基因;他們還通過插入突變的方法獲得了一株無毒力的鮑曼不動(dòng)桿菌。那么各種耐藥基因盒的隨機(jī)插入，是否引起臨床上不同耐藥表型AB致病力的改變呢?本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)全敏感和泛耐藥兩組AB對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附及致其病變情況的觀察，分析兩組AB之間黏附定植及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力上的差異。

對(duì)象與方法

1.菌株基本情況:(1)鑒定與藥敏:40株AB均采用Walk-Away 96SI全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行鑒定及藥敏。所測抗菌藥物包括:頭孢噻肟、頭孢他啶、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、替卡西林/克拉維酸、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南、復(fù)方新諾明、妥布霉素、左旋氧氟沙星、頭孢曲松、氨曲南和頭孢哌酮/舒巴坦。(2)菌株分布:20株泛耐藥菌株均分離自成人ICU患者的痰液標(biāo)本，20株全敏感菌株分離自新生兒、兒童留觀室、兒童感染科和兒童呼吸科患者的痰液標(biāo)本。泛耐藥菌株為對(duì)上述17種藥物均耐藥，全敏感菌株則對(duì)上述17種藥物均敏感。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)試劑:Hep－2細(xì)胞株購自上海細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基按GIBCO的說明書配制，小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，0.25%的胰酶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均購自吉泰生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，凋亡DNA Ladder提取試劑盒購自上海超研生物科技有限公司。

3.方法:(1)菌株的培養(yǎng):各菌株分別接種于LB肉湯，37℃過夜的培養(yǎng)，然后用PBS調(diào)菌液濃度為3×108CFU/ml備用。(2)菌株對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附功能測定:將2.5×105個(gè)/毫升的Hep－2細(xì)胞懸液接種于內(nèi)置蓋玻片的含RPMI 1640培養(yǎng)液3ml的6孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)后，用事先預(yù)熱的PBS沖洗3次，分別加入菌懸液0.5m l，37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)2h，取出蓋玻片，PBS漂洗3次，自然干燥，甲醇固定15 min，革蘭染色，油鏡下觀察菌株對(duì)細(xì)胞的黏附情況并隨機(jī)計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算兩組AB的平均細(xì)胞黏附率和黏附指數(shù)。細(xì)胞黏附率=被細(xì)菌黏附的細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)× 100%，細(xì)胞黏附指數(shù) =黏附細(xì)菌數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù) × 100%。(3)受染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)及凋亡現(xiàn)象的檢測:將Hep－2細(xì)胞分別接種于含和不含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔加3m l培養(yǎng)液，待細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)孔后，用事先預(yù)熱的PBS洗2次，再加入3m l培養(yǎng)液;取0.5m l菌懸液分別加入到含和不含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每株菌各加8個(gè)孔，放37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育，分別在8、12、16、20h觀察細(xì)胞變化并收集細(xì)胞。取出蓋玻片進(jìn)行瑞氏染色，觀察凋亡小體。收集的細(xì)胞按細(xì)胞凋亡－DNA Ladder抽提試劑盒說明書操作提取DNA，然后進(jìn)行電泳。

結(jié)果

1.鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附:①黏附形式:全敏感菌株對(duì)細(xì)胞的黏附多以周圍分散廣泛黏附為主;泛耐藥菌株以在細(xì)胞的某一區(qū)域局部黏附為主，且更易被細(xì)胞吞噬。如下圖1所示;②平均細(xì)胞黏附率和黏附指數(shù):兩組AB的細(xì)胞黏附率和黏附指數(shù)如表1所示。

2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:全敏感菌株組引起細(xì)胞形態(tài)改變明顯，16h時(shí)Hep－2細(xì)胞已基本變圓浮起，20h時(shí)幾乎無貼壁細(xì)胞。泛耐藥菌株組引起細(xì)胞形態(tài)改變相對(duì)較緩慢，20h時(shí)仍有一些貼壁細(xì)胞。具體變化如圖2所示。

圖1 不同AB菌株黏附于Hep－2細(xì)胞的形式A.AB在細(xì)胞周圍的廣泛黏附;B.AB在細(xì)胞的局部黏附;C.部分細(xì)菌被吞入細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)

表1 兩組AB對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附情況(%±s)

表1 兩組AB對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附情況(%±s)

兩組之間比較，*P＜0.05

組別 平均細(xì)胞黏附率 平均細(xì)胞黏附指數(shù)全敏感組 57.05±4.93* 105.2±9.53*泛耐藥組 40.20±4.56* 111.1±9.26*

3.凋亡細(xì)胞的觀察:感染后各菌株各時(shí)間段標(biāo)本經(jīng)瑞氏染色，油鏡下觀察，以16h細(xì)胞變化最大，破碎的細(xì)胞多見。典型的凋亡細(xì)胞較少見。各種細(xì)胞形態(tài)如圖3所示。

4.細(xì)胞凋亡的瓊脂糖電泳檢測:兩組鮑曼不動(dòng)桿菌均可誘導(dǎo)Hep－2細(xì)胞發(fā)生凋亡，但時(shí)間上略有差異。全敏感組致細(xì)胞凋亡高峰多出現(xiàn)在12～16h;泛耐藥組致細(xì)胞凋亡高峰多出現(xiàn)16～20h。部分菌株凋亡電泳圖如圖4所示。

討論

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)干燥及普通的消毒劑具有極強(qiáng)的耐受性，對(duì)由該菌引起的院內(nèi)感染病人，在其出院9天后，其床邊物表仍可分離到同一克隆菌株［2］。眾多的研究表明，無論是省內(nèi)、國內(nèi)還是國際上都存在幾個(gè)多重耐藥克隆株引起醫(yī)院感染的報(bào)道［3～5］。多重耐藥克隆菌株較敏感克隆菌株更易播散，但兩者的致病能力有何差異，目前的研究尚未揭示答案。

圖4 兩組細(xì)菌在不同時(shí)間點(diǎn)致Hep－2細(xì)胞凋亡的典型凋亡電泳圖

鮑曼不動(dòng)桿菌不分泌毒素和侵襲性酶類，其毒力因子和致病機(jī)制也是目前的研究熱點(diǎn)。Nural等［6］報(bào)道稱鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附存在甘露糖抵抗現(xiàn)象，這種甘露糖抵抗的黏附現(xiàn)象是由P型菌毛介導(dǎo)的，具有受體特異性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，全敏感組菌株對(duì)Hep－2細(xì)胞的黏附方式以分散廣泛黏附為主，而泛耐藥菌株的黏附以大量細(xì)菌局部黏附為主，由此推測全敏感菌株表面黏附素的表達(dá)較泛耐藥組菌株充分，導(dǎo)致黏附方式存在差異，這可能與細(xì)胞的吞噬殺傷相關(guān)，同時(shí)大量的細(xì)菌局部聚集還可能形成了生物被膜或其他的原因造成免疫逃逸，短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致細(xì)菌與細(xì)胞共存。目前對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌毒力因子的研究中，以外膜蛋白(outer membrane proteins，OMP)的研究較為深入。OMP不僅在細(xì)菌的耐藥中起重要作用，而且在細(xì)菌侵入和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞病變中也扮演重要角色。Choi等［7，8］認(rèn)為OmpA直接介導(dǎo)了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)上皮細(xì)胞的侵入;在鮑曼不動(dòng)桿菌感染宿主細(xì)胞后Omp38定位于宿主細(xì)胞線粒體和細(xì)胞核，并釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C和AIF，后者介導(dǎo)caspase依賴和AIF依賴的凋亡機(jī)制，促使上皮細(xì)胞凋亡。Mussi等的研究表明，當(dāng)carO基因前有插入序列時(shí)，會(huì)發(fā)生插入失活導(dǎo)致carO基因不表達(dá)。說明外來的插入序列可能導(dǎo)致菌株OMP基因的失活。國內(nèi)王輝等［4］通過亞胺培南體外突變篩選研究發(fā)現(xiàn)，菌株的OMP圖譜發(fā)生很大的改變，存在一些OMP的缺失和表達(dá)量降低。本實(shí)驗(yàn)中泛耐藥組細(xì)菌致細(xì)胞病變緩慢而不明顯，誘導(dǎo)Hep－2細(xì)胞凋亡時(shí)間較全敏感組菌株滯后，可能與泛耐藥組菌株存在OMP缺失和表達(dá)量降低有關(guān)，同時(shí)也說明鮑曼不動(dòng)桿菌還存在其他的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的毒力因子。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從宏觀上證明藥敏情況完全不同的兩組細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附和致病變能力存在較大差異。說明泛耐藥菌株在各種抗菌藥物的壓力下可能處于一種營養(yǎng)不良狀態(tài)，一方面毒力因子的弱表達(dá)，致病變能力減弱的同時(shí)導(dǎo)致了免疫逃逸，另一方面耐藥基因的獲得和自身突變，增強(qiáng)了對(duì)抗菌藥物的耐受。這可能是多重耐藥克隆株易于流行的部分原因。同時(shí)我們還需警惕強(qiáng)毒力株的產(chǎn)生，各種可移動(dòng)元件的隨機(jī)插入可能導(dǎo)入外源毒力基因，也可能活化菌株自身毒力基因的高表達(dá)，從而誘導(dǎo)出強(qiáng)毒力株，所以需要臨床工作中的長期關(guān)注。

1 Smith GM，Gianoulis TA，Pukatzki S，etal.New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high－density pyrosequencing and transposon mutagenesis［J］.Genes Dev，2007，21(5):601－614

2 Richet HM.Nosocomial gram negative bacilli:they are back!Dealing with Acinetobacter，44thInterscience conference on Antimicrobial A-gents and chemotheraphy，October30～November2，2004，Washington DC

3 裘莉佩，潘登，徐煒烽，等.鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因型及分子流行病學(xué)研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2007，28(4):381－384

4 王輝，郭萍，孫宏莉，等.碳青霉烯酶類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌分子流行病學(xué)及其泛耐藥的分子機(jī)制［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29 (12):1066－1073

5 Federico P，Andrea MH，Kristine MH，etal.Global challenge ofmultidrug－resistant acinetobacter baumannii［J］.Antimicrobial Agents Chemotherapy，2007，51(10):3471－3484

6 Nural C，Melek D，Ilknur K，et al.Evaluation of biofilm production gelatinase actibity and mannose－resistant hemagglutination in acinetobacter baumannii strains［J］.J Microbiol Immunol Infect.2008，41 (10):513－518

7 ChoiCH，Lee JS，Lee YC，etal.acinetobacter baumannii invadesepithelial cells and outer membrane protein A mediates interactions with epithelial cells［J］.BMCMicrobiol，2008，8(10):216－227

8 Choi CH，Lee EY，Lee YC，etal.Outermembrane protein 38 of acinetobacter baumannii localizes to themitochondria and induces apoptosis of epithelial cells［J］.Cell Microbiol，2005，7(8):1127－1138