王 芳 何 吉 朱發(fā)明 劉晉輝 秦 斐 陳 舒 徐 罡 呂杭軍 嚴(yán)力行

人體血液中的血小板在出凝血功能中具有重要的作用，血小板數(shù)量降低的病人容易發(fā)生大量出血，特別是接受高劑量化療和造血干細(xì)胞移植的病人，體內(nèi)長時(shí)期血小板減少的治療一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)。巨核細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化而成，其產(chǎn)生血小板是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，到目前為止其分子機(jī)制仍不明確。本實(shí)驗(yàn)采用人臍血干細(xì)胞體外TPO誘導(dǎo)擴(kuò)增分化為巨核細(xì)胞，分別應(yīng)用基因芯片技術(shù)和solexa測序技術(shù)檢測MKs、非MKs的基因和mRNA表達(dá)差異，探討巨核細(xì)胞的表達(dá)機(jī)制、信號傳導(dǎo)及調(diào)控機(jī)制，為造血干細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞用于臨床輸注打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料:臍帶血由浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院提供。IMEM培養(yǎng)基、RPMI1640購自美國 Gibco公司;血小板生成素(TPO)、無血清培養(yǎng)基(Stem SpanTMSFEM)購自加拿大Stem Cell公司;鼠抗人CD41a一抗購自捷克Exbio公司;CD34細(xì)胞MACS磁珠分選試劑盒購自德國美天尼公司;羊抗鼠IgG免疫磁珠購自美國DYNAL公司;光學(xué)顯微鏡購自Nikon公司;TRIzol Reagent購自美國 Invitrogen公司，RNA純化(QIAamp RNA Blood Mini Kit)購自德國QIAGEN公司;RNA抽提試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)購自德國Qiagen公司;RTPCR試劑盒(SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis System)購自美國Invitrogen公司;引物自行設(shè)計(jì)，由上海申能博彩公司合成;基因芯片制作及軟件分析由上海生物芯片有限公司提供;solexa測序及軟件分析由杭州華大基因研發(fā)中心提供。

2.方法:(1)HSCs的體外分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化:臍帶血標(biāo)本與生理鹽水以1∶1充分混勻，加到比重為1.077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液上，收集中間的單個(gè)核細(xì)胞層，MACS磁珠分選 CD34+造血干細(xì)胞。將富集的細(xì)胞用含100ng/m l TPO無血清培養(yǎng)基混勻后，1×105/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%飽和CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天，第7天半量換液。(2)巨核細(xì)胞的分離:將培養(yǎng)的細(xì)胞加入鼠抗人CD41a抗體(1μg/L×106細(xì)胞)，2～8℃孵育10min，Buffer (pH7.4)洗滌。加入羊抗鼠免疫磁珠(25μl/L×107細(xì)胞)孵育，將試管放置于磁鐵中2min，收集上清中的非巨核細(xì)胞(非MKs)，取去磁鐵，用Buffer重懸細(xì)胞。(3)總RNA提取:采用QIAamp RNA Blood Mini Kit，按照試劑盒內(nèi)說明書操作。(4)基因芯片制備:將分選的MKs、非MKs細(xì)胞加入TRIzol試劑(1毫升/5×106細(xì)胞)，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不黏稠的液體。-80℃冰箱中保存。將TRIzol試劑處理后的細(xì)胞用干冰送至上海生物芯片有限公司檢測、分析。芯片型號Affymetrix U133plus2.0。本研究選用2張芯片對MKs和非MKs細(xì)胞cDNA樣本作平行分析。(5)Solexa測序:將抽提好的MKs、非MKs RNA用干冰送至華大基因研發(fā)中心進(jìn)行表達(dá)譜樣品制備、solexa測序、信息分析。

結(jié)果

1.CD34+細(xì)胞純度、CD41+細(xì)胞純度、總RNA提取結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞平均純度達(dá)90%，顯微鏡下觀察CD41+細(xì)胞純度達(dá)85%(圖1)。分別提取MKs、非MKs細(xì)胞的總RNA，在進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片和solexa測序?qū)嶒?yàn)前進(jìn)行總RNA的質(zhì)量檢驗(yàn)，結(jié)果符合要求。

2.基因芯片雜交數(shù)據(jù)分析結(jié)果:基因芯片結(jié)果采用Affymetrix掃描儀進(jìn)行掃描，GCOS1.4軟件讀取、處理數(shù)據(jù)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是:以|log ratio|≥1作為判斷基因表達(dá)差異的閾值，log ratio≥1為上調(diào)基因;log ratio≤-1，為下調(diào)基因。從38000多個(gè)基因表達(dá)譜中篩選MK和非MK細(xì)胞的差異基因1834個(gè)，上調(diào)基因?yàn)?11個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?123個(gè)。

圖1 分選后CD61+細(xì)胞

3.Solexa數(shù)據(jù)分析結(jié)果:solexa技術(shù)檢測MK和非MK細(xì)胞表達(dá)譜的基本情況，其中獲取的Tag初始數(shù)量MK和非MK細(xì)胞分別為3773147和3533805個(gè)。整個(gè)清晰的Tag數(shù)量分別為3291132和2967947個(gè)，明顯獨(dú)特的Tag數(shù)量分別為197769和245318個(gè)，未知的Tag數(shù)量分別為4496和4204個(gè)，分別占清晰Tag的2.27%和1.71%。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是:以FDR≤0.001，|log2Ratio|≥1作為判斷基因表達(dá)差異顯著的閾值，log2ratio≥1為上調(diào)基因; log2ratio≤ -1，為下調(diào)基因。差異表達(dá)基因數(shù)為2063個(gè)，上調(diào)基因表達(dá)數(shù)量為1161個(gè)，下調(diào)為902個(gè)。差異表達(dá)Tag數(shù)為Tag4236個(gè)，上調(diào)Tag數(shù)量為2717個(gè)，下調(diào)為1519個(gè)。

4.基因芯片檢測結(jié)果與solexa測序技術(shù)檢測結(jié)果比較分析:基因芯片與solexa測序技術(shù)檢測的MK與非MK差異表達(dá)基因中有507個(gè)是相同的，其中144個(gè)為上調(diào)基因，363個(gè)為下調(diào)基因。

討論

人體血液中的血小板在出凝血功能中具有重要的作用，通過體外輸注獻(xiàn)血者的血小板可有效地提高病人體內(nèi)的血小板數(shù)量，然而這種治療手段需要反復(fù)輸注血小板。近年來發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞輸注到病人體內(nèi)后，能加速病人血小板的恢復(fù)，縮短血小板缺乏期，這將為化療或移植后的血小板減少癥提供一個(gè)潛在的新的治療途徑。

巨核細(xì)胞生成血小板是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞增殖和分化過程，目前該過程的信號傳導(dǎo)、調(diào)控機(jī)制尚不清楚。近年來人們一直在探討其可能的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用人臍帶血干細(xì)胞體外TPO誘導(dǎo)生成巨核細(xì)胞，經(jīng)過免疫磁珠法分選，得到巨核細(xì)胞，純度可達(dá)85%以上。本實(shí)驗(yàn)分別采用基因芯片技術(shù)和solexa測序技術(shù)對擴(kuò)增后的MKs、非MKs基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，探討其基因表達(dá)機(jī)制。

表達(dá)譜基因芯片是用于基因組功能研究的一種應(yīng)用型芯片，在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮廣泛的作用［1，2］，是集分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等多種高新技術(shù)為一體的研究手段?；蛐酒夹g(shù)經(jīng)過近15年的發(fā)展已經(jīng)形成了一個(gè)系統(tǒng)的平臺，從樣品制備、芯片制作、芯片雜交、數(shù)據(jù)掃描到后期的數(shù)據(jù)管理、儲存以及深度數(shù)據(jù)挖掘都有了標(biāo)準(zhǔn)化的流程，成為一個(gè)非常穩(wěn)定可信的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)也積累了龐大的公共數(shù)據(jù)庫。芯片雜交結(jié)果直觀，分析快速，適合對大量生物學(xué)樣品進(jìn)行已知信息的檢測，同時(shí)芯片數(shù)據(jù)分析有成熟完整的系統(tǒng)，為后期數(shù)據(jù)分析提供強(qiáng)大的支持。

Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)是基于新一代高通量測序技術(shù)的全基因組表達(dá)譜分析方法，高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，可以幫助研究者跨過文庫構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過程中引入的偏差，依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對照參比基因組完成基因組測序［3～6］。

基因芯片的缺點(diǎn)在于只能檢測人們已知序列的特征。而高通量測序的強(qiáng)項(xiàng)就在于可以直接對任何物種進(jìn)行包括未知基因在內(nèi)的全基因組表達(dá)譜分析，其發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。作為兩個(gè)高通量的基因組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面存在重疊和競爭，但是在更多方面是優(yōu)勢互補(bǔ)，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術(shù)難以解決的問題。如 Euskirchen等［7］同時(shí)用ChIP-chip和ChIP-seq對STAT1的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，兩種技術(shù)的檢測結(jié)果具有非常好的相關(guān)性，而對于一些結(jié)合位點(diǎn)，Ch IP-chip和ChIP-seq都會丟失部分信息，而一種方法丟失的信息又恰好能被另一種方法所檢出，完整的數(shù)據(jù)是來自兩部分的整合。Oudes等應(yīng)用基因芯片和高通量測序技術(shù)對前列腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)同樣的情況。

本實(shí)驗(yàn)我們同時(shí)應(yīng)用基因芯片和solexa技術(shù)對臍血造血干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的巨核細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，基因芯片技術(shù)從38000多個(gè)基因表達(dá)譜中篩選MK和非MK細(xì)胞的差異基因，上調(diào)基因?yàn)?07個(gè)，下調(diào)基因?yàn)?326個(gè)。Solexa技術(shù)檢測MK和非MK細(xì)胞表達(dá)譜，獲取的Tag初始數(shù)量MK和非MK細(xì)胞分別為3773147和3533805個(gè)。整個(gè)清晰的Tag數(shù)量分別為3291132和2967947個(gè)，明顯獨(dú)特的Tag數(shù)量分別為197769和245318個(gè)，其中基因表達(dá)數(shù)量上調(diào)為1661個(gè)，下調(diào)數(shù)量為902個(gè)。Tag表達(dá)量上調(diào)為2717個(gè)，下調(diào)為1519個(gè)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，solexa技術(shù)檢測的基因數(shù)和Tag數(shù)量明顯高于基因芯片技術(shù)。對于差異表達(dá)基因，基因芯片和solexa技術(shù)的檢測到相同的基因507個(gè)，基因芯片檢測到1327個(gè)獨(dú)特的基因，solexa測序技術(shù)檢測到1556個(gè)獨(dú)特基因。這表明一種技術(shù)能彌補(bǔ)另一種技術(shù)遺漏的部分，因此需要不同實(shí)驗(yàn)技術(shù)的協(xié)同配合。應(yīng)用兩種方法共同檢測到的MK和非MK差異表達(dá)基因功能與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、新陳代謝、細(xì)胞發(fā)育、運(yùn)動、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞黏連等功能有關(guān)，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動、細(xì)胞分裂等細(xì)胞生理活動方面發(fā)揮著重要的作用。而兩種方法各自檢出的差異基因同樣涉及這些功能，表明MKs和非MKs細(xì)胞基因表達(dá)存在顯著差異，同時(shí)solexa表達(dá)譜結(jié)果顯示約有2%的tag屬于未知的序列，提示solexa表達(dá)譜分析技術(shù)更易發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄組。

通過用基因芯片和solexs技術(shù)對MKs和非MKs基因表達(dá)譜的研究，可以發(fā)現(xiàn)大量有差異表達(dá)的基因，以及solexa測序發(fā)現(xiàn)的潛在調(diào)控基因和未知序列，有利于推動對人臍血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞基因表達(dá)分子機(jī)制研究，從基因表達(dá)模式上更好地了解各個(gè)基因的功能，更有效地進(jìn)行基因功能分類，從而尋找最佳的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子，使巨核細(xì)胞在體外得以高效擴(kuò)增用于臨床診斷和治療。

研究者可以充分享受基因芯片和solexs技術(shù)這兩個(gè)平臺，在利用solexs技術(shù)獲取新信息的基礎(chǔ)上，利用芯片的強(qiáng)項(xiàng)，即對已知信息的高通量、相對低成本的檢測能力，對大量樣品進(jìn)行快速檢測，短時(shí)間內(nèi)獲得有大量有效的數(shù)據(jù)。

1 Kim JA，Jung YJ，Seoh JY，et al.Gene expression profile of megakaryocytes from human cord blood CD34+cells ex vivo expanded by thrombopoietin［J］.Stem cell，2002，20(5):402-416

2 Kim HL.Comparison of oligonucleotide-microarray and serial analysis of gene expression (SAGE)in transcript profiling analysis of megakaryocytes derived from CD34+cells［J］.Experimental and molecularmedicine，2003，35(5):460-466

3 Aury JM，Cruaud C，Barbe V，et al.High quality draft sequences for prokaryotic genomes using a mix of new sequencing technologies［J］.BMCGenomics，2008，9:603-613

4 Bau S，Schracke N，Kr?nzle M，et al.Targeted next-generation se-quencing by specific capture ofmultiple genomic loci using low-volumemicrofluidic DNA arrays［J］.Anal Bioanal Chem，2009，393(1): 171-175

5 Trick M，Long Y，Meng J，et al.Single nucleotide polymorphism (SNP)discovery in the polyploid Brassica napus using Solexa transcriptome sequencing［J］.Plant Biotechnol J，2009，7(4):334-346

6 Hanriot L，Keime C，Gay N，et al.A combination of LongSAGE with Solexa sequencing iswell suited to explore the depth and the complexity of transcriptome［J］.BMCGenomics，2008，9:418-426

7 Euskirchen GM，Rozowsky JS，Wei CL，et al.Mapping of transcription factor binding regions in mammalian cells by ChIP:comparison of array-and sequencing-based technologies［J］.Genome Res，2007，17:898-909