李美蓉 李 興

糖尿病心肌病是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年來研究顯示，氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的共同通路。銜接蛋白p66shc在氧化應(yīng)激信號(hào)刺激下參與線粒體活性氧族產(chǎn)生，血紅蛋白加氧酶－1(Ho－1)為膽紅素降解的限速酶，是一種重要的抗氧化劑，兩者變化影響體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)糖、脂代謝和介導(dǎo)各種血管通路中起中心調(diào)節(jié)蛋白作用，可以通過抑制氧自由基產(chǎn)生，增加抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)觀察了高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對(duì)心肌細(xì)胞p66shc、Ho－1表達(dá)的變化，旨在探討脂聯(lián)素對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

材料與方法

1.材料:人心肌細(xì)胞購于美國SinceCell公司，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及細(xì)胞染色法鑒定。DMEM、0.25%胰蛋白酶、D－葡萄糖、青霉素鏈霉素(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青)、人重組脂聯(lián)素(PEPRO TECH公司)、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物公司)、Trizol試劑(Initrogen life technologies公司)、SYRB Green Mastar(Roche公司)、AnnexinV－FITC/PI(南京凱基公司)。

2.方法:(1)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱?人心肌細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下以10%胎牛血清低糖(5.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，以無血清低糖DMEM饑餓培養(yǎng)細(xì)胞12h，待細(xì)胞生長至85%融合狀態(tài)時(shí)，按以下方法分組:①對(duì)照組(N組):D－葡萄糖濃度5.5mmol/L;②高糖組(H組):D－葡萄糖濃度30mmol/L;③高糖+脂聯(lián)素組(A組):D－葡萄糖濃度30mmol/L+脂聯(lián)素濃度2.5μg/L。分別干預(yù)24、48、72h。(2)上清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測:分別用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的含量和活性，用代巴比妥酸法檢測MDA的含量。將細(xì)胞分為上述3組，每組設(shè)置24、48、72h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)瓶中的上清液，密封后于－20℃保存。按SOD、MDA試劑盒說明檢測各管吸光度，根據(jù)SOD、MDA含量公式計(jì)算其含量。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法:應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物，并有康成生物有限公司合成。內(nèi)參β－actin:上游:5'－agagctacgagctgcctgac－3'下游:5'－agcactgtgttggcgtacag－3'Ho－1:上游:5'－tccgatgggtccttacactc－3'下游:5'－taaggaagccagccaagaga－3'，P66Shc:上游:5'－cagctcttggcattttcctc－3'下游:5'－cagtctcgcggtaagagacc－3'。在上述各組個(gè)時(shí)間點(diǎn)棄上清的培養(yǎng)瓶中加入Trizol試劑裂解細(xì)胞后，按照說明書操作提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR儀并使用SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件:熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μl，在PCR擴(kuò)增儀上按照94℃預(yù)變性10min，活化Tag酶;94℃15s，60℃60s，45個(gè)循環(huán)結(jié)束。熒光定量PCR讀取CT值，采用2－ΔΔCt的方法計(jì)算Ho－1、P66Shc mRNA表達(dá)情況的相對(duì)定量結(jié)果。(4)流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率:采用AnnexinV－FITC/PI雙標(biāo)記染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡率。按上述分組將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，待測細(xì)胞濃度為0.5×108～1×109，PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入500μl Binding Buffer于細(xì)胞懸浮液中，加入5μl AnnexinV－FITC混勻后，加入5μl PI，混勻，室溫避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡率。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量，反應(yīng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。與對(duì)照組相比24、48、72h高糖組SOD含量顯著下降，MDA含量顯著上升(P＜0.05)，與高糖組相比，脂聯(lián)素組SOD含量顯著上升，MDA含量顯著下降(P＜0.05，表1、表2)。

2.血紅蛋白加氧酶1和銜接蛋白P66Shc mRNA表達(dá):與對(duì)照組相比高糖組Ho－1 mRNA表達(dá)增高;脂聯(lián)素組較高糖組表達(dá)亦增高(P＜0.05)。與對(duì)照組相比高糖組P66Shc mRNA表達(dá)增高;脂聯(lián)素組較高糖組表達(dá)亦降低(P＜0.05)(表3、表4)。

3.流式細(xì)胞術(shù)心肌細(xì)胞凋亡:高糖組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增加，而脂聯(lián)素組細(xì)胞凋亡率較高糖組顯著下降(P＜0.05)(表5)。

表1 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞SOD的影響(U/m l±s，n=3)

表1 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞SOD的影響(U/m l±s，n=3)

與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

33.89±2.54 34.13±1.13 33.72±3.58高糖組 25.88±0.48* 23.74±0.52* 21.08±1.31*高糖+脂聯(lián)素組 28.76±0.79 30.21±0.61# 31.16±0.93 24h 48h 72h低糖組組別#

表2 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞MDA的影響(nmol/L±s，n=3)

表2 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞MDA的影響(nmol/L±s，n=3)

與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

117.36±10.74 114.49±8.71 115.53±9.20高糖組 231.51±3.52*267.62±4.96*301.47±3.41*高糖+脂聯(lián)素組 178.50±8.00#171.31±4.47#157.69±3.05 24h 48h 72h低糖組組別#

表3 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞Ho－1 mRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct 值±s，n=3)

表3 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞Ho－1 mRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct 值±s，n=3)

與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

1.026±0.009 1.039±0.012 1.042±0.009高糖組 1.728±0.183 2.216±0.240*2.6851±0.301*高糖+脂聯(lián)素組 3.889±0.006#7.632±0.231#8.375±0.051 24h 48h 72h低糖組組別#

表4 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞P66ShcmRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct值±s，n=3)

表4 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞P66ShcmRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct值±s，n=3)

與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

1.058±0.031 1.030±0.176 1.049±0.023高糖組 1.521±0.079*1.767±0.119*2.112±0.094*高糖+脂聯(lián)素組 1.318±0.023#1.196±0.020#1.072±0.016 24h 48h 72h低糖組組別#

表5 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞凋亡率的影響(%±s，n=3)

表5 脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞凋亡率的影響(%±s，n=3)

與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

組別4.68±1.24 4.77±1.89 5.06±1.67高糖組 15.29±1.46* 18.19±0.98* 23.85±0.76*高糖+脂聯(lián)素組 10.98±0.68# 8.31±0.26# 7.59±0.41 24h 48h 72h低糖組#

討論

糖尿病是一種以血糖代謝紊亂為特點(diǎn)的常見慢性疾病，在心臟可引起冠心病和糖尿病性心臟病。目前認(rèn)為高血糖介導(dǎo)氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。Brownlee［1］提出，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的共同機(jī)制，并認(rèn)為多元醇通路激活、蛋白非酶糖基化產(chǎn)物晚期糖基化產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C激活、己糖胺途徑激活都是由這一共同機(jī)制所激發(fā)。

銜接蛋白P66Shc是哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)的蛋白，也是近年來研究細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要蛋白之一，其通過在線粒體內(nèi)氧化細(xì)胞色素C產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷［2］。P66Shc表達(dá)的調(diào)控包含2個(gè)層次，即翻譯后調(diào)控和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。P66Shc的表達(dá)主要取決于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，即它的啟動(dòng)子發(fā)生了表觀遺傳學(xué)的修飾，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)發(fā)生改變［3］。Rota等［4］的研究證實(shí)，高葡萄糖可以誘導(dǎo)離體的心臟干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加，并發(fā)生凋亡，而從p66shc－/－小鼠體內(nèi)分離的心臟干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡，提示p66shc介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的氧化損傷。Sun等［5］的研究表明，在體外，高糖環(huán)境的腎小管上皮細(xì)胞P66Shc及其磷酸化形式表達(dá)增加，氧化應(yīng)激水平增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。本實(shí)驗(yàn)檢測p66shc的mRNA水平反應(yīng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

血紅蛋白加氧酶－1是血紅蛋白降解的限速酶，產(chǎn)生當(dāng)量摩爾的一氧化碳、鐵、膽綠素，是一種重要的抗氧化劑。關(guān)美萍［6］研究發(fā)現(xiàn):初診2型糖尿病(T2DM)合并慢性并發(fā)癥患者的血糖水平、血清MDA、外周血單核細(xì)胞ROS產(chǎn)量及HO－1表達(dá)(mRNA or protein)均顯著高于無并發(fā)癥的患者，HO－1表達(dá)(mRNA or protein)與氧化應(yīng)激指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。Vulapalli等［7］的研究證實(shí):轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)(mRNA or protein)α－肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子使心臟選擇性過度表達(dá)(mRNA or protein)HO－1，離體心臟和在體心臟在缺血再灌注損傷后，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因鼠心臟恢復(fù)功能增強(qiáng)，心肌細(xì)胞凋亡減少。本試驗(yàn)檢測HO－1mRNA水平反應(yīng)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，除參與糖脂代謝外，還具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗等作用。Prior等［8］得研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素啟動(dòng)子rs266729 3種變異基因型與糖尿病患者氧化應(yīng)激水平之間的關(guān)聯(lián)，GG型患者血漿脂聯(lián)素水平高，對(duì)應(yīng)的總抗氧化水平高，血漿氧化修飾低密度脂蛋白(oxidativelymodified low density lipoprotein，OX－LDL)水平低;CC/CG型患者血漿脂聯(lián)素水平低，對(duì)應(yīng)的總抗氧化水平低，血漿OX－LDL水平高，說明脂聯(lián)素通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用。Essick等［9］研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑、抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)活化調(diào)節(jié)活性氧族(ROS)的量，抑制ROS誘導(dǎo)的心室重構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞不同時(shí)間段氧化應(yīng)激水平和凋亡的檢測，觀察脂聯(lián)素對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞p66shc表達(dá)較正常組增加，加入脂聯(lián)素組較高糖組降低。MDA是氧自由基和脂質(zhì)反應(yīng)的終產(chǎn)物，可間接反應(yīng)氧自由基的多少。MDA的變化與p66shcRNA變化正相關(guān)。提示高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)較正常組高，脂聯(lián)素組較高糖組低。由此可以推測脂聯(lián)素可能通過降低p66shc mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)，使磷酸化的p66shc表達(dá)減少，降低氧化應(yīng)激水平，但是本實(shí)驗(yàn)局限性未能做全各個(gè)水平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞隨時(shí)間梯度HO－1 mRNA較正常組表達(dá)升高，是因?yàn)镠O－1是應(yīng)激性蛋白，但是結(jié)合MDA和SOD含量說明機(jī)體自身抗氧化防御功能的代償增高尚不足以對(duì)抗高糖所致氧化應(yīng)激，加入脂聯(lián)素后HO－1 mRNA較高糖組表達(dá)升高，結(jié)合MDA和SOD含量可以反映氧化應(yīng)激水平降低。說明脂聯(lián)素通過增加HO－1 mRNA的含量使心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平升高，減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，脂聯(lián)素通過影響p66shc、HO－1表達(dá)影響減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，提高存活率。因此在積極控制血糖的同時(shí)，脂聯(lián)素可能成為治療糖尿病并發(fā)癥的新途徑。

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