李美蓉 李 興

糖尿病心肌病是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年來研究顯示，氧化應(yīng)激是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的共同通路。銜接蛋白p66shc在氧化應(yīng)激信號刺激下參與線粒體活性氧族產(chǎn)生，血紅蛋白加氧酶－1(Ho－1)為膽紅素降解的限速酶，是一種重要的抗氧化劑，兩者變化影響體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)糖、脂代謝和介導(dǎo)各種血管通路中起中心調(diào)節(jié)蛋白作用，可以通過抑制氧自由基產(chǎn)生，增加抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激。本實驗觀察了高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對心肌細(xì)胞p66shc、Ho－1表達(dá)的變化，旨在探討脂聯(lián)素對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

材料與方法

1.材料:人心肌細(xì)胞購于美國SinceCell公司，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及細(xì)胞染色法鑒定。DMEM、0.25%胰蛋白酶、D－葡萄糖、青霉素鏈霉素(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青)、人重組脂聯(lián)素(PEPRO TECH公司)、SOD、MDA試劑盒(南京建成生物公司)、Trizol試劑(Initrogen life technologies公司)、SYRB Green Mastar(Roche公司)、AnnexinV－FITC/PI(南京凱基公司)。

2.方法:(1)實驗?zāi)Ｐ椭谱?人心肌細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下以10%胎牛血清低糖(5.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中。實驗時，以無血清低糖DMEM饑餓培養(yǎng)細(xì)胞12h，待細(xì)胞生長至85%融合狀態(tài)時，按以下方法分組:①對照組(N組):D－葡萄糖濃度5.5mmol/L;②高糖組(H組):D－葡萄糖濃度30mmol/L;③高糖+脂聯(lián)素組(A組):D－葡萄糖濃度30mmol/L+脂聯(lián)素濃度2.5μg/L。分別干預(yù)24、48、72h。(2)上清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測:分別用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的含量和活性，用代巴比妥酸法檢測MDA的含量。將細(xì)胞分為上述3組，每組設(shè)置24、48、72h 3個時間點，取每組每個時間點培養(yǎng)瓶中的上清液，密封后于－20℃保存。按SOD、MDA試劑盒說明檢測各管吸光度，根據(jù)SOD、MDA含量公式計算其含量。(3)實時熒光定量PCR法:應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計引物，并有康成生物有限公司合成。內(nèi)參β－actin:上游:5'－agagctacgagctgcctgac－3'下游:5'－agcactgtgttggcgtacag－3'Ho－1:上游:5'－tccgatgggtccttacactc－3'下游:5'－taaggaagccagccaagaga－3'，P66Shc:上游:5'－cagctcttggcattttcctc－3'下游:5'－cagtctcgcggtaagagacc－3'。在上述各組個時間點棄上清的培養(yǎng)瓶中加入Trizol試劑裂解細(xì)胞后，按照說明書操作提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR儀并使用SYBR Green法實時熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件:熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μl，在PCR擴增儀上按照94℃預(yù)變性10min，活化Tag酶;94℃15s，60℃60s，45個循環(huán)結(jié)束。熒光定量PCR讀取CT值，采用2－ΔΔCt的方法計算Ho－1、P66Shc mRNA表達(dá)情況的相對定量結(jié)果。(4)流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡率:采用AnnexinV－FITC/PI雙標(biāo)記染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡率。按上述分組將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，待測細(xì)胞濃度為0.5×108～1×109，PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，加入500μl Binding Buffer于細(xì)胞懸浮液中，加入5μl AnnexinV－FITC混勻后，加入5μl PI，混勻，室溫避光孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞的凋亡率。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，各實驗組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.細(xì)胞上清液中SOD、MDA含量，反應(yīng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。與對照組相比24、48、72h高糖組SOD含量顯著下降，MDA含量顯著上升(P＜0.05)，與高糖組相比，脂聯(lián)素組SOD含量顯著上升，MDA含量顯著下降(P＜0.05，表1、表2)。

2.血紅蛋白加氧酶1和銜接蛋白P66Shc mRNA表達(dá):與對照組相比高糖組Ho－1 mRNA表達(dá)增高;脂聯(lián)素組較高糖組表達(dá)亦增高(P＜0.05)。與對照組相比高糖組P66Shc mRNA表達(dá)增高;脂聯(lián)素組較高糖組表達(dá)亦降低(P＜0.05)(表3、表4)。

3.流式細(xì)胞術(shù)心肌細(xì)胞凋亡:高糖組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加，而脂聯(lián)素組細(xì)胞凋亡率較高糖組顯著下降(P＜0.05)(表5)。

表1 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞SOD的影響(U/m l±s，n=3)

表1 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞SOD的影響(U/m l±s，n=3)

與正常對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

33.89±2.54 34.13±1.13 33.72±3.58高糖組 25.88±0.48* 23.74±0.52* 21.08±1.31*高糖+脂聯(lián)素組 28.76±0.79 30.21±0.61# 31.16±0.93 24h 48h 72h低糖組組別#

表2 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞MDA的影響(nmol/L±s，n=3)

表2 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞MDA的影響(nmol/L±s，n=3)

與正常對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

117.36±10.74 114.49±8.71 115.53±9.20高糖組 231.51±3.52*267.62±4.96*301.47±3.41*高糖+脂聯(lián)素組 178.50±8.00#171.31±4.47#157.69±3.05 24h 48h 72h低糖組組別#

表3 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞Ho－1 mRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct 值±s，n=3)

表3 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞Ho－1 mRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct 值±s，n=3)

與正常對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

1.026±0.009 1.039±0.012 1.042±0.009高糖組 1.728±0.183 2.216±0.240*2.6851±0.301*高糖+脂聯(lián)素組 3.889±0.006#7.632±0.231#8.375±0.051 24h 48h 72h低糖組組別#

表4 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞P66ShcmRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct值±s，n=3)

表4 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞P66ShcmRNA表達(dá)的影響(2－△△Ct值±s，n=3)

與正常對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

1.058±0.031 1.030±0.176 1.049±0.023高糖組 1.521±0.079*1.767±0.119*2.112±0.094*高糖+脂聯(lián)素組 1.318±0.023#1.196±0.020#1.072±0.016 24h 48h 72h低糖組組別#

表5 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞凋亡率的影響(%±s，n=3)

表5 脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下人心肌細(xì)胞凋亡率的影響(%±s，n=3)

與正常對照組相比，*P＜0.05;與高糖組相比，#P＜0.05

組別4.68±1.24 4.77±1.89 5.06±1.67高糖組 15.29±1.46* 18.19±0.98* 23.85±0.76*高糖+脂聯(lián)素組 10.98±0.68# 8.31±0.26# 7.59±0.41 24h 48h 72h低糖組#

討論

糖尿病是一種以血糖代謝紊亂為特點的常見慢性疾病，在心臟可引起冠心病和糖尿病性心臟病。目前認(rèn)為高血糖介導(dǎo)氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。Brownlee［1］提出，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的共同機制，并認(rèn)為多元醇通路激活、蛋白非酶糖基化產(chǎn)物晚期糖基化產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C激活、己糖胺途徑激活都是由這一共同機制所激發(fā)。

銜接蛋白P66Shc是哺乳動物生命周期相關(guān)的蛋白，也是近年來研究細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要蛋白之一，其通過在線粒體內(nèi)氧化細(xì)胞色素C產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷［2］。P66Shc表達(dá)的調(diào)控包含2個層次，即翻譯后調(diào)控和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。P66Shc的表達(dá)主要取決于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，即它的啟動子發(fā)生了表觀遺傳學(xué)的修飾，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始位點發(fā)生改變［3］。Rota等［4］的研究證實，高葡萄糖可以誘導(dǎo)離體的心臟干細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加，并發(fā)生凋亡，而從p66shc－/－小鼠體內(nèi)分離的心臟干細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡，提示p66shc介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的氧化損傷。Sun等［5］的研究表明，在體外，高糖環(huán)境的腎小管上皮細(xì)胞P66Shc及其磷酸化形式表達(dá)增加，氧化應(yīng)激水平增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。本實驗檢測p66shc的mRNA水平反應(yīng)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

血紅蛋白加氧酶－1是血紅蛋白降解的限速酶，產(chǎn)生當(dāng)量摩爾的一氧化碳、鐵、膽綠素，是一種重要的抗氧化劑。關(guān)美萍［6］研究發(fā)現(xiàn):初診2型糖尿病(T2DM)合并慢性并發(fā)癥患者的血糖水平、血清MDA、外周血單核細(xì)胞ROS產(chǎn)量及HO－1表達(dá)(mRNA or protein)均顯著高于無并發(fā)癥的患者，HO－1表達(dá)(mRNA or protein)與氧化應(yīng)激指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。Vulapalli等［7］的研究證實:轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)(mRNA or protein)α－肌球蛋白重鏈啟動子使心臟選擇性過度表達(dá)(mRNA or protein)HO－1，離體心臟和在體心臟在缺血再灌注損傷后，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，轉(zhuǎn)基因鼠心臟恢復(fù)功能增強，心肌細(xì)胞凋亡減少。本試驗檢測HO－1mRNA水平反應(yīng)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，除參與糖脂代謝外，還具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗等作用。Prior等［8］得研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素啟動子rs266729 3種變異基因型與糖尿病患者氧化應(yīng)激水平之間的關(guān)聯(lián)，GG型患者血漿脂聯(lián)素水平高，對應(yīng)的總抗氧化水平高，血漿氧化修飾低密度脂蛋白(oxidativelymodified low density lipoprotein，OX－LDL)水平低;CC/CG型患者血漿脂聯(lián)素水平低，對應(yīng)的總抗氧化水平低，血漿OX－LDL水平高，說明脂聯(lián)素通過抗氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用。Essick等［9］研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途徑、抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)活化調(diào)節(jié)活性氧族(ROS)的量，抑制ROS誘導(dǎo)的心室重構(gòu)。

本實驗通過對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞不同時間段氧化應(yīng)激水平和凋亡的檢測，觀察脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞p66shc表達(dá)較正常組增加，加入脂聯(lián)素組較高糖組降低。MDA是氧自由基和脂質(zhì)反應(yīng)的終產(chǎn)物，可間接反應(yīng)氧自由基的多少。MDA的變化與p66shcRNA變化正相關(guān)。提示高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)較正常組高，脂聯(lián)素組較高糖組低。由此可以推測脂聯(lián)素可能通過降低p66shc mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響蛋白表達(dá)，使磷酸化的p66shc表達(dá)減少，降低氧化應(yīng)激水平，但是本實驗局限性未能做全各個水平。本實驗發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞隨時間梯度HO－1 mRNA較正常組表達(dá)升高，是因為HO－1是應(yīng)激性蛋白，但是結(jié)合MDA和SOD含量說明機體自身抗氧化防御功能的代償增高尚不足以對抗高糖所致氧化應(yīng)激，加入脂聯(lián)素后HO－1 mRNA較高糖組表達(dá)升高，結(jié)合MDA和SOD含量可以反映氧化應(yīng)激水平降低。說明脂聯(lián)素通過增加HO－1 mRNA的含量使心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激水平升高，減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，脂聯(lián)素通過影響p66shc、HO－1表達(dá)影響減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，提高存活率。因此在積極控制血糖的同時，脂聯(lián)素可能成為治療糖尿病并發(fā)癥的新途徑。

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6 關(guān)美萍.糖尿病患者慢性并發(fā)癥與外周血單核細(xì)胞血紅素加氧酶1表達(dá)的相關(guān)性研究［J］.中國糖尿病雜志，2009，17(12):929－932

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