陳永青 鄭 續(xù) 邵蒙蒙 王小同

目前，慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已經(jīng)不再單純的被認為是一個肺臟疾病，還累及多個肺外器官，其肺外表現(xiàn)有骨骼肌功能障礙、體重減輕、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病等［1］。尤其是骨骼肌萎縮及體重減輕，在COPD患者的自然病程中普遍存在，近年來有關(guān)研究認為骨骼肌萎縮與COPD患者的病死率密切相關(guān)，Agusti等［2，3］在嚴重體重下降的COPD患者中發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞凋亡增加，導(dǎo)致骨骼肌纖維數(shù)量減少，從而引起骨骼肌萎縮，提示凋亡引起的細胞死亡也許是COPD骨骼肌萎縮的重要機制之一。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，慢性低氧高二氧化碳血癥可導(dǎo)致小鼠骨骼肌凋亡指數(shù)明顯升高，并出現(xiàn)肌纖維局部萎縮和線粒體部分損害，伴有炎癥細胞浸潤增多，提示凋亡可能參與了COPD引起的小鼠骨骼肌萎縮，炎癥反應(yīng)激活的死亡受體途徑及線粒體途徑可能參與了COPD引起的骨骼肌細胞凋亡［4］。本實驗?zāi)MCOPD的發(fā)病機制，建立COPD模型，通過觀察干預(yù)后的caspase－3的含量變化，進一步探討凋亡是否參與了COPD導(dǎo)致的骨骼肌萎縮，同時觀察實驗組與正常對照組Cyt－C及細胞凋亡因子Bax、Bcl－2基因的表達情況，探討線粒體途徑在慢性低O2高CO2小鼠骨骼肌細胞凋亡中的作用及其可能的調(diào)節(jié)機制。

材料與方法

1.儀器與設(shè)備:動物實驗復(fù)合模擬艙(濰坊華信氧業(yè)有限公司)、酶標儀(芬蘭Thermo公司)、洗板機(芬蘭Thermo公司)、LithtCycler480實時定量PCR儀(羅氏公司)。

2.實驗動物及分組:成年storage protect feature(SPF)級雄性C57BL/6小鼠16只(由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體重20～30g，按隨機數(shù)字表法分為實驗組8只和正常對照組8只。

3.模型建立:實驗組置于低O2高CO2艙中(吸入氣O2濃度為9.0%～11.0%，CO2濃度為5.0%～6.0%)，每天8h，每周6天。其余時間與對照組在同一室內(nèi)(室溫15～20℃，相對濕度50%～70%)，對照組除吸入空氣外(正?？諝庵蠴2濃度為21%，CO2濃度為0.03%)，其他條件與實驗組相同［5］。

4.骨骼肌組織取材:干預(yù)結(jié)束后，用1%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定，迅速分離，取左右兩側(cè)股外側(cè)肌，經(jīng)液氮冷凍后放入－70℃冰箱保存，用于ELISA測定和實時定量熒光PCR測定。

5.ELISA法測定caspase－3含量:稱量骨骼肌重量，加入90%體積冰PBS液(pH=7.4)，研磨缽充分研磨，1500r/min離心10min(4℃中進行)，取上清液，制成10%的組織溶液，4℃保存待測。用ELISA法檢測樣本中caspase－3的含量。嚴格按照說明書操作步驟進行，于酶標儀上450nm波長檢測各孔的光密度(optical density，OD)值。用Ascent software for Multiskan分析軟件，以O(shè)D值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)樣本的OD值在標準曲線上讀出樣本中所測物質(zhì)的量。

6.實時熒光定量PCR檢測Cyt－CmRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA的表達:用Trizol(Invitrogen公司)抽提總mRNA，提取1μl RNA樣品，采用紫外分光光度法測定RNA純度，以O(shè)D260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之間。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)說明書操作，進行反轉(zhuǎn)錄。PCR引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成。Cyt－C引物序列為上游:5'－agcctgggctacacagagaa－3'，下游:5'－actcacacaacctgctgcac－3';Bax引物序列為上游:5'－tgcagaggatgattgctgac－3'，下游:5'－gatcagctcgggcactttag－3';Bcl－2引物序列為上游:5'－aggagcaggtgcctacaaga－3'，下游:5'－gcattttcccaccactgtct－3'，采用GAPDH作為內(nèi)參照。用LithtCycler 480實時定量PCR儀(羅氏公司)檢測，實驗重復(fù)3次。通過比較△Ct的方法進行目的基因表達的定量分析，Cyt－C、Bax、Bcl－2的相對表達量用2－△△Ct表示。Ct為每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，△Ct為Cyt－C mRNA、BaxmRNA、Bcl－2 tmRNA值與內(nèi)參照Ct值之差?！鳌鰿t值為實驗組Cyt－CmRNA、Bax mRNA、Bcl－2 tmRNA△Ct值與正常對照組△Ct值之差。

結(jié)果

1.骨骼肌細胞質(zhì)內(nèi)caspase－3的水平:與正常對照組(n=8)25.76±5.20ng/m l相比，實驗組(n=8)骨骼肌細胞內(nèi)caspase－3水平(39.69±14.66ng/ml)升高(P＜0.05)。

2.熒光實時定量PCR結(jié)果:定量PCR結(jié)果采用2－△△Ct相對表達量分析法，以正常對照組基因表達量作為基數(shù)，在此基礎(chǔ)上比較實驗組的Cyt－CmRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA表達量。實驗組的Cyt－C mRNA、BaxmRNA、Bcl－2 mRNA的2－△△Ct值分別為5.80±0.70、20.56±3.03、0.93±0.23。說明相對于正常對照組，實驗組的Cyt CmRNA、Bax mRNA呈高表達，而Bcl－2 mRNA呈低表達(表1)。

表1 實驗組小鼠骨骼肌Cyt C mRNA、Bax m RNA、Bcl－2 mRNA的表達±s)

表1 實驗組小鼠骨骼肌Cyt C mRNA、Bax m RNA、Bcl－2 mRNA的表達±s)

指標 △△Ct值 2－△△Ct 值Cyt－CmRNA －2.57±0.14 5.80±0.70 BaxmRNA －4.34±0.22 20.56±3.03 Bcl－2 mRNA 4.34±0.58 0.05±0.01

討論

COPD是一種全身性疾病，除了有典型的肺部病理表現(xiàn)外，肺外表現(xiàn)如骨骼肌功能障礙也成為近幾年的研究熱點。骨骼肌萎縮作為COPD的肺外效應(yīng)愈來愈受到人們的關(guān)注，引起骨骼肌萎縮的原因有很多，如能量攝人不足、能量消耗過多、蛋白質(zhì)分解代謝異常及炎癥刺激、組織缺氧、皮質(zhì)激素的使用等，但其具體的分子生物學(xué)機制尚未明確。近年來，有研究認為細胞凋亡是COPD骨骼肌萎縮的原因之一，也有研究認為在COPD的穩(wěn)定期，體重相對恒定的患者并未發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞凋亡［5，6］。因此，細胞凋亡是否參與了COPD骨骼肌萎縮，及其可能的作用機制，有待進一步證實。

細胞凋亡是細胞循自身程序結(jié)束其生命的主動死亡的過程，具有特征的形態(tài)和生化改變，是由基因控制的個別細胞發(fā)生的自主有序的死亡。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，實驗組小鼠骨骼肌細胞胞質(zhì)內(nèi)caspase－3含量增加，caspase－3處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細胞凋亡的內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)和外源性途徑(死亡受體途徑)的重要匯聚點，主要與細胞凋亡的最終執(zhí)行有關(guān)，是效應(yīng)caspase。本實驗進一步證實凋亡參與了COPD導(dǎo)致的骨骼肌萎縮［7］。

Cyt－C是第1個被發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白，在線粒體呼吸鏈中傳遞電子，起到載體的作用，其從線粒體釋放到細胞質(zhì)這一過程是引起細胞凋亡的關(guān)鍵［8］。本實驗慢性低O2高CO2導(dǎo)致小鼠骨骼肌線粒體損傷，Cyt－C被釋放到胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf－1)、dATP、procaspase－9組成凋亡體(apoptosome)，凋亡體使procaspase－9激活，進而激活其下游的procaspase－3，活化的caspase－3啟動細胞凋亡［9］。本研究通過RT－PCR檢測到實驗組骨骼肌細胞胞質(zhì)內(nèi)Cyt－C mRNA表達較正常對照組增加(P＜0.05)，提示線粒體途徑是COPD骨骼肌細胞凋亡的可能機制之一。

Bcl－2家族是目前較為公認的與凋亡密切相關(guān)的基因，包括抗凋亡的Bcl－2和促凋亡的Bax蛋白等，其主要調(diào)控線粒體途徑。有研究表明，Bcl－2家族成員定位于線粒體膜上，其主要通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性來發(fā)揮作用［10］。本實驗觀察到:與正常對照組相比，實驗組小鼠骨骼肌Bax mRNA表達增高，而Bcl－2 mRNA表達降低，Bax受到慢性低O2高CO2刺激后能夠發(fā)生空間構(gòu)象改變，通過被暴露的C末端疏水結(jié)構(gòu)域插入到線粒體外膜上，改變線粒體膜的通透性致使Cyt－C釋放，進而激活下游的caspases－3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［11］。Bcl－2是一種最早被發(fā)現(xiàn)的抑制細胞凋亡的蛋白，主要位于線粒體，可以調(diào)節(jié)膜的通透性，其抑制細胞凋亡的作用與Bax的促凋亡作用相對［12，13］。Bcl－2與Bax的比值對細胞凋亡起決定作用，Bcl－2/Bax下降是促進細胞線粒體途徑凋亡的重要因素。本研究顯示，實驗組小鼠骨骼肌細胞內(nèi)Bcl－2/Bax下降，加速了線粒體途徑的細胞凋亡，促進骨骼肌細胞的死亡。

總之，本研究進一步證實凋亡參與了COPD引起的骨骼肌萎縮，線粒體途徑可能是COPD骨骼肌細胞凋亡的機制之一，至于COPD是否同時通過其他機制促進骨骼肌細胞的凋亡，尚有待進一步研究探討。另外，Bcl－2/Bax下降可能是促進骨骼肌細胞線粒體途徑凋亡的重要因素。

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