章順榮 高 越 封 菲 洪鳴鳴

糖尿病常引起大小血管病變，大血管病變中最常見(jiàn)的是動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病是冠心病的等危癥，然而糖尿病易患動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制仍未完全明了。糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)起著重要作用，AGEs可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展［1］。AGEs能引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能異常，而后者在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。組成縫隙連接的蛋白亞單位稱為connexins，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)20種以上的connexins亞型，內(nèi)皮細(xì)胞表面有connexin37、40和43的表達(dá)［2］。connexins在維持內(nèi)皮整體功能協(xié)調(diào)中起著重要作用，研究表明connexin43的改變與內(nèi)皮功能異常及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［3］。AGEs是否可以通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞connexin43表達(dá)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展尚不明確。本研究對(duì)AGEs是否可影響體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelium cells，HUVECs)connexin43的表達(dá)做一探索。

材料與方法

1.材料:牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，D－葡萄糖，1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清購(gòu)自上海澤衡生物科技公司，內(nèi)皮細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技公司，Trizol和 RT－PCR試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，connexin43和GAPDH引物對(duì)由上海澤衡生物科技公司合成，兔抗人connexin43多克隆抗體購(gòu)于Abcam公司(Catalog Number ab62689)，熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體，山羊血清，C液購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司，Triton X－100購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，DAB顯色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

2.AGEs的制備:0.5mol/L的D－葡萄糖和50mg/m l牛血清白蛋白溶解在0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液中，用0.2μm的濾器過(guò)濾除菌后置于37℃恒溫箱內(nèi)避光孵育。90天后取出，AGE－BSA呈深黃色，裝入低分子量透析袋，以PBS液充分透析72h，中途更換透析液1～2次以除去未結(jié)合的低分子物質(zhì)。透析后用0.2μm的濾器過(guò)濾除菌后－80℃保存。用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)AGE－BSA最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，檢測(cè)AGE－BSA的蛋白濃度為50mg/m l。

3.內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及AGEs的干預(yù):人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株接種于6孔板培養(yǎng)基，常規(guī)傳代，待內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%滿后換液，對(duì)照組繼續(xù)以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，而另外3組則在10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的AGEs，使AGEs的終濃度分別為100mg/L，200mg/ L，400mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，PBS液沖洗后，加入Trizol 2ml，提取各組的總RNA，－20℃條件下保存。另兩組內(nèi)皮細(xì)胞按2×104/ml濃度接種于含有載玻片的6孔板培養(yǎng)基，分為對(duì)照組和200mg/L AGEs干預(yù)組，待內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿80%玻片后換液，對(duì)照組繼續(xù)以含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，干預(yù)組則在培養(yǎng)液中加入終濃度為200mg/ L的AGEs，繼續(xù)培養(yǎng)24h后去除培養(yǎng)液，PBS液沖洗后進(jìn)行免疫熒光染色。

4.connexin43基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè):提取的各組RNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260和280nm處吸光度值，計(jì)算RNA純度和濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物對(duì)，connexin43基因的PCR引物序列為5'－GAGCGGATAC AGAGGAG GA－3'(上游)，5'－CTCCACCCATCTACCCCATAC－3'(下游)。內(nèi)參GAPDH的引物序列為:5'－CGTGAAAGATGTCGTGGAA－3'(上游)，5'－TGGAAGATGGTGA TG GGAT－3'(下游)。connexin43基因PCR擴(kuò)增條件為: 95℃ 5min 1循環(huán)，之后95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10min 1循環(huán)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為383次/分;內(nèi)參GAPDH基因PCR擴(kuò)增條件為:95℃5min 1循環(huán)，之后95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃10min 1循環(huán)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為223bp。PCR反應(yīng)體系為20μl體系。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果，Bio RAD成像系統(tǒng)拍攝照片用于分析。

5.connexin43蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):主要步驟如下:①PBS清洗標(biāo)本3次各1min;②4%的多聚甲醛固定20min;③空氣干燥5min;④PBS清洗標(biāo)本3次各2min;⑤0.5%Triton X－100孵育1次20min;⑥PBS清洗標(biāo)本3次各2min;⑦3% H2O2孵育15min，DPBS清洗標(biāo)本3次各2min;⑧標(biāo)本予以兔抗人connexin43多克隆抗體(效價(jià)1∶200)4℃孵育過(guò)夜;⑨PBS液沖洗4次，各5min，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min;⑩PBS液沖洗4次后90%甘油封片。最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，拍攝照片用于分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:運(yùn)用ImageJ 1.43圖像分析軟件對(duì)mRNA電泳圖片和免疫細(xì)胞熒光染色圖片進(jìn)行灰度掃描半定量分析。運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。mRNA電泳圖片采用各組connexin43條帶與其GAPDH條帶的灰度比值作為統(tǒng)計(jì)變量，采用t檢驗(yàn)分析;免疫細(xì)胞熒光染色圖片以細(xì)胞灰度值作為統(tǒng)計(jì)變量，采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞connexin43基因mRNA表達(dá)的影響:不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs干預(yù)24h后引起內(nèi)皮細(xì)胞connexin43 mRNA的表達(dá)水平上調(diào)(表1和圖1)。

表1 不同濃度AGEs對(duì)HUVECs connexin43 m RNA表達(dá)的影響(n=6±s)

表1 不同濃度AGEs對(duì)HUVECs connexin43 m RNA表達(dá)的影響(n=6±s)

*與對(duì)照組相比，P＜0.01

0.38±0.024 100mg/L AGEs干預(yù)組 0.94±0.037* 200mg/L AGEs干預(yù)組 1.01±0.034* 400mg/L AGEs干預(yù)組 0.92±0.065組別 灰度比值對(duì)照組*

圖1 不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs刺激后內(nèi)皮細(xì)胞connexin43 m RNA表達(dá)水平

2.AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞connexin43基因蛋白表達(dá)的影響:見(jiàn)圖2。對(duì)照組及200mg/L的AGEs干預(yù)組24h后 connexin43灰度值分別為 64.28±4.34、97.41±6.80。免疫熒光方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.01)。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果

討論

糖尿病常引起全身大血管和小血管病變，研究表明合并糖尿病的冠心病患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變更嚴(yán)重、更彌漫，AGEs在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用［4］。AGEs的形成先由還原葡萄糖的醛基或酮基與生物分子如蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的游離氨基反應(yīng)形成早期可逆產(chǎn)物堿，再經(jīng)分子內(nèi)重排形成更穩(wěn)定的產(chǎn)物進(jìn)一步脫水和凝聚形成不可逆的終末產(chǎn)物，呈棕黃色，可發(fā)熒光，糖尿病及慢性腎功能不全患者，體內(nèi)AGEs的積聚明顯增加［5］。AGEs能通過(guò)多種途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。AGEs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞能增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮素－1、血管細(xì)胞黏附分子－1、細(xì)胞間黏附分子－1、E－選擇素、組織因子、血栓素、白細(xì)胞介素IL－1、IL－6、腫瘤壞死因子，以及AGEs受體(RAGE)等，促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起單核－吞噬細(xì)胞遷移，吞噬脂質(zhì)，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程，促進(jìn)早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［6］。研究表明，抑制糖尿病患者體內(nèi)AGEs的形成能有效延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［7］。

近年來(lái)connexin43在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用日益引起人們的重視［8］。人類冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的早期，其增厚的內(nèi)膜中縫隙連接蛋白connexin43表達(dá)明顯增強(qiáng)［9］。Kwak等［10］研究表明通過(guò)connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)與LDL受體基因缺陷的帶有正常connexin43基因的小鼠(LDLR－/－Cx43+/ +)相比，其connexin43蛋白表達(dá)減少，喂養(yǎng)高膽固醇飼料14周后其胸腹主動(dòng)脈和主動(dòng)根部動(dòng)脈粥樣病變比LDLR－/－Cx43+/+減少50%(P＜0.01)，且LDLR－/－Cx43+/－小鼠粥樣硬化斑塊中含更少的炎癥細(xì)胞，有更厚的纖維帽，含更多的膠原和平滑肌細(xì)胞。他汀類調(diào)脂藥能減少血管內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的表達(dá)，而他汀類藥物的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能也與此有關(guān)［11］。Dai等［12］模擬斑塊易感和抵抗區(qū)域的動(dòng)脈波型，應(yīng)用于培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)其表型進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑塊易感波形引起connexin43表達(dá)上調(diào)。Chadjichristos等研究發(fā)現(xiàn)connexin43基因半敲除的LDL受體基因缺陷的小鼠(LDLR－/－Cx43+/－)球囊損傷頸動(dòng)脈內(nèi)膜后其新生內(nèi)膜的厚度比LDLR－/－Cx43+/+的小鼠減小，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)也更少?？傊?，目前的研究提示內(nèi)皮connexin43可能具有促動(dòng)脈粥樣硬化作用，減少connexin43的表達(dá)能相應(yīng)的減輕動(dòng)脈粥樣硬化病變的程度。而作為糖尿病血管病變關(guān)鍵因素的AGEs能否影響內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的表達(dá)尚不清楚，這是一個(gè)值得研究的靶點(diǎn)。

本研究用AGEs干預(yù)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以觀察AGEs能否影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度(100、200、400mg/L)的AGEs均能引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞connxin43基因mRNA的表達(dá)增加;200mg/L的AGEs干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h后可引起connexin43蛋白的表達(dá)水平增加。這些結(jié)果提示AGEs干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后在轉(zhuǎn)錄水平引起縫隙連接蛋白connexin43基因的表達(dá)上調(diào)。由于內(nèi)皮connexin43可能有促動(dòng)脈粥樣硬化作用，AGEs可通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的表達(dá)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

AGEs引起內(nèi)皮細(xì)胞connexin43基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究明確。目前研究表明人類connexin43基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，涉及轉(zhuǎn)錄因子Sp1、Sp3、AP1、Nkx2.5、Tbx2等，此外，幾條信號(hào)通路也參與了connexin43的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。AGEs與其受體RAGE結(jié)合可激活內(nèi)皮細(xì)胞多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起多種核轉(zhuǎn)錄因子的激活和轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中也可能包括connexin43基因，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞connexin43的表達(dá)上調(diào)，當(dāng)然尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究初步提示，AGEs短期干預(yù)能引起體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白connexin43基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平增加，提示內(nèi)皮connexin43在AGEs促動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。本研究對(duì)糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探索具有一定的意義，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治也有一定啟示作用。

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