麻益可 沈國(guó)芳 王麗珍

自Urist首先發(fā)現(xiàn)了BMP，以后的研究發(fā)現(xiàn)BMP具有促進(jìn)成骨作用。在BMP家族中，BMP－2、BMP－4、BMP－7的成骨能力最強(qiáng)。rhBMP－2已經(jīng)被證實(shí)在骨愈合中有促進(jìn)成骨作用［1，2］。Wurzler等［3］發(fā)現(xiàn)rhBMP－2可以促進(jìn)大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)，盡管修復(fù)的骨量仍然低于為放射組。目前，尚無(wú)rh-BMP－2作用于放射后頜骨骨延長(zhǎng)的研究和報(bào)道。通過(guò)先期的研究表明，放射后兔下頜骨骨延長(zhǎng)的新生骨形成受到了抑制。本研究的目的就在于在截骨間隙置入rhBMP－2以觀察其能否促進(jìn)新生骨的形成。

材料與方法

1.材料:本研究置入材料核心成分是rhBMP－2，載體材料是藥用明膠、大豆卵磷脂及羥基磷灰石，由杭州華東基因技術(shù)研究所贊助提供。牽引器由浙江慈北醫(yī)療器械公司提供，依據(jù)兔下頜骨定制的手控式內(nèi)置式牽引器，由牽引桿、牽引體和固定腳組成，牽引螺距為0.40mm/360°，最長(zhǎng)牽引長(zhǎng)度為15.0mm。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)及分組:雄性新西蘭大白兔，約6月齡，體重2.0～3.0kg，共12只兔。兔入圈圈養(yǎng)1周，隨機(jī)化實(shí)驗(yàn)分為兩組，每組各6只，具體如下:①對(duì)照組:術(shù)前接受50Gy放射劑量，間歇1個(gè)月后進(jìn)行骨延長(zhǎng);②rhBMP－2組:與對(duì)照的差別僅在術(shù)中置入骨優(yōu)導(dǎo)，其他均一致。

3.放射處理:由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科放療室提供專(zhuān)業(yè)放射人員和Theration 780－C型60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)(AECLmedical，加拿大)，照射方式是外照射。隨機(jī)確定實(shí)驗(yàn)放射側(cè)，放射在全麻下進(jìn)行。以第1前磨牙前緣中點(diǎn)為放射中心，照射野大小為3.0cm×3.0cm，源皮距為80cm，表面覆蓋一層等效物。放射方案為:每次5.6Gy，每天照射1次，連續(xù)照射5天(根據(jù)TDF表，上述放射方案相當(dāng)于常規(guī)放射的25次50Gy)。

4.手術(shù):術(shù)前無(wú)需禁食，肌內(nèi)注射速眠新Ⅱ液0.1ml/kg和氯氨酮0.1ml/kg，麻醉起效后，雙側(cè)頜下、面部和頸部備皮，剪除兔毛。側(cè)臥于手術(shù)臺(tái)，四肢固定，常規(guī)消毒鋪巾。手術(shù)部位加以0.5%利多卡因皮下局部注射，以加強(qiáng)麻醉效果。對(duì)照組:切口于放射側(cè)下頜下，切開(kāi)皮膚及皮下組織，長(zhǎng)約2.0cm，尋及面動(dòng)靜脈予以結(jié)扎、剪斷，以減少出血。暴露下頜骨頰側(cè)，橫行切開(kāi)骨膜并剝離骨膜，顯露下頜骨骨質(zhì)、頦孔和下牙槽神經(jīng)，剪斷下牙槽神經(jīng)，推開(kāi)。剝離時(shí)保護(hù)頰側(cè)牙齦附著，避免與口腔相通。舌側(cè)骨膜不予剝離，以盡量保留下頜骨血供。截骨于第1前磨牙前和頦孔間。于下頜角切開(kāi)長(zhǎng)約3mm皮膚切口，牽引桿穿過(guò)皮下層和該切口，放置于其后方，預(yù)安置牽引器，各骨段2枚自鉆螺釘固定，拆除牽引器。以φ1mm小球鉆以2000r/min的速度逐層去除頰側(cè)骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)，同時(shí)予無(wú)菌生理鹽水沖洗、冷卻;舌側(cè)骨皮質(zhì)以骨鑿輕輕鑿斷。伸入骨鑿于截骨線(xiàn)，以能完全撬動(dòng)兩側(cè)骨段為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)，原位復(fù)置牽引器。創(chuàng)口沖洗，充分止血，常規(guī)縫合關(guān)創(chuàng)。于對(duì)側(cè)相同位置以相同方法截?cái)嘞骂M骨，不安置牽引器，逐層關(guān)創(chuàng)。術(shù)中根據(jù)需要，可適時(shí)追加麻醉藥物初次劑量的半量。rhBMP－2組與對(duì)照組的差別在于:試牽引成功后，復(fù)位;創(chuàng)口沖洗，充分止血后將rhBMP－2填入截骨間隙。待兔完全蘇醒，送回籠中，與精飼料為主，卷心菜為輔喂養(yǎng)。術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始肌內(nèi)注射30000U青霉素，每天2次，連續(xù)注射7天。

5.牽引方案:間歇8天后開(kāi)始牽引，每天0.4mm，每天2次，連續(xù)牽引10天，固定期6周。

6.觀察和評(píng)價(jià)指標(biāo):(1)活體觀察:術(shù)后觀察兔的進(jìn)食、創(chuàng)口愈合等情況。固定期6周結(jié)束時(shí)，處死后取得兩側(cè)下頜骨離體標(biāo)本。觀察新生骨的外形和質(zhì)地，測(cè)量新生骨的長(zhǎng)度。(2)X線(xiàn)片評(píng)價(jià):分別于牽引結(jié)束次日、固定期3周和固定期6周時(shí)在拍攝下頜骨橫斷咬合X線(xiàn)片以觀察牽引間隙是否有效形成、牽引間隙內(nèi)骨質(zhì)狀況等。(3)HE組織學(xué):離體標(biāo)本拍好X線(xiàn)后立即鋸取新生骨，以10%中性緩沖甲醛液固定，由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科病理室完成脫鈣、脫水、石蠟包埋、切片和HE染色等，切片切面為下頜骨橫斷面。

隨機(jī)取每個(gè)標(biāo)本最中央且放大倍數(shù)為4×10的圖片4張，應(yīng)用Image－Pro Plus 4.5.1圖像分析軟件進(jìn)行組織學(xué)半定量分析，分別測(cè)量新生骨骨小梁總面積和視野總面積，并計(jì)算骨小梁面積比，記平均值。計(jì)算公式:骨小梁面積比=骨小梁面積總面積/視野總面積。數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.活體觀察:所有動(dòng)物都完成了實(shí)驗(yàn)，有效形成牽引間隙并存活到固定期6周。牽引完成后，下頜明顯偏向?qū)?cè)，上下前牙均處于空咬狀態(tài)。上下前牙隨時(shí)間推移而伸長(zhǎng)，并造成下頜口腔黏膜的創(chuàng)傷性潰瘍，但均不影響進(jìn)食。

2.大體標(biāo)本觀察:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的螺釘均與骨組織固定牢固。實(shí)驗(yàn)側(cè)下頜骨新生骨均呈直線(xiàn)延長(zhǎng)，延長(zhǎng)長(zhǎng)度6.7±1.1mm。所有舌側(cè)、上下端及頰側(cè)骨皮質(zhì)與周?chē)琴|(zhì)無(wú)明顯的界限，連續(xù)性完好，難以區(qū)分原有骨質(zhì)與新生骨的界限。頰舌側(cè)骨質(zhì)均致密，質(zhì)硬(圖1)。兩組在大體標(biāo)本上無(wú)明顯差別。對(duì)側(cè)的截骨部位也可見(jiàn)臨床正常愈合，未見(jiàn)骨段間的錯(cuò)位愈合，難以分辨出截骨線(xiàn)。

3.X線(xiàn)檢查:牽引結(jié)束次日，均可見(jiàn)牽引間隙有效形成;牽引間隙內(nèi)為低密度軟組織透光區(qū)，截骨邊緣銳利清晰，無(wú)骨質(zhì)形成跡象。骨優(yōu)導(dǎo)透射X線(xiàn)，未能顯影。固定期3周時(shí)，均可見(jiàn)整個(gè)牽引間隙內(nèi)較均勻、密度略低于正常的阻射影，呈細(xì)條帶排列，方向與牽引力方向一致，截骨邊緣模糊不清，骨皮質(zhì)影隱約可見(jiàn)，但是未見(jiàn)典型的骨小梁結(jié)構(gòu)和中央?yún)^(qū)。rhBMP－2組牽引間隙內(nèi)，可以區(qū)分出骨皮質(zhì)。50Gy組未見(jiàn)明顯的骨皮質(zhì)高密度影。固定期6周時(shí)，牽引間隙內(nèi)充滿(mǎn)高密度影，密度與周?chē)琴|(zhì)相似，原截骨邊緣消失;可見(jiàn)骨小梁，均勻分布于新生骨內(nèi)，排列方向與牽引方向一致。頰舌側(cè)骨皮質(zhì)致密。分辨不出兩組間的差別(圖2)。

4.組織學(xué)觀察:HE染色兩組均可見(jiàn)形成新生骨組織，密質(zhì)骨和松質(zhì)骨均可見(jiàn)帶狀淺藍(lán)色類(lèi)骨質(zhì)，骨小梁排列方向均與牽引方向相同。兩組的骨小梁均較稀疏、細(xì)小，分布較均勻;密質(zhì)骨和骨小梁內(nèi)含有豐富的骨細(xì)胞，骨細(xì)胞核呈圓形，骨陷窩周?chē)画h(huán)形類(lèi)骨質(zhì)包繞;大部分骨小梁邊緣可見(jiàn)大量為柱狀或立方

圖2 X線(xiàn)圖

狀成行緊密排列的成骨細(xì)胞，排列整齊;未見(jiàn)哈佛氏系統(tǒng)和破骨細(xì)胞，骨髓均為脂肪性骨髓。兩組中均未見(jiàn)軟骨形成。所有12個(gè)標(biāo)本的骨小梁間都可以見(jiàn)到成片狀致密纖維結(jié)締組織(圖3)。

圖3 HE染色組織學(xué)表現(xiàn)

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果:rhBMP－2組和50Gy組骨小梁面積比分別為0.459±0.036，0.445±0.054。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P=0.61(＞0.05)，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

BMP是一種疏水酸性糖蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)BMP－1～13，其中起重要作用是BMP－2、BMP－4、BMP－7。BMP能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂和轉(zhuǎn)化，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，從而促進(jìn)成骨［4～6］。研究還表明rhBMP－2具有強(qiáng)大的促進(jìn)成骨作用，而且rhBMP－2誘導(dǎo)形成的新骨，經(jīng)組織學(xué)、生物力學(xué)和放射影像學(xué)證實(shí)，與正常骨質(zhì)無(wú)差別［7，8］。Wurzler等［3］研究發(fā)現(xiàn)rhBMP－2可以促進(jìn)大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)，但是形成的新骨仍不如未放射者。在本研究中rhBMP－2組和50Gy組的新生骨頰舌側(cè)骨皮質(zhì)均致密、質(zhì)硬。在牽引結(jié)束后、固定期3周、6周的X線(xiàn)片，都顯示相似的成骨表現(xiàn)。組織學(xué)可見(jiàn)兩組的骨小梁密度均較稀疏、細(xì)小，骨小梁間存在致密纖維結(jié)締組織。這些均提示，rhBMP－2未能促進(jìn)兔下頜骨放射后骨延長(zhǎng)的新生骨形成。

研究表明，新生骨的形成量和骨密度與局部置入的rhBMP－2初始濃度和持續(xù)時(shí)間正相關(guān)。rhBMP－2單獨(dú)局部使用效果并不理想，主要原因是rhBMP－2作為多肽生長(zhǎng)因子在局部很容易被稀釋、分解和吸收，不能長(zhǎng)久有效的刺激靶細(xì)胞。因此，具有緩釋性能的rhBMP－2產(chǎn)品更有利于成骨［9］。本研究術(shù)中同期置入的核心和主要成分是二聚體rhBMP－2，純度在95%以上，且其中含有具有緩釋性能的少量卵磷脂作為載體，在2～3周內(nèi)緩慢完全釋放。

眾多研究表明rhBMP－2也可以在骨延長(zhǎng)中可以促進(jìn)成骨。諸多等研究表明rhBMP－2對(duì)骨延長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)新生骨形成作用［10，11］。研究發(fā)現(xiàn)，rh-BMP－2最佳局部濃度與動(dòng)物種屬級(jí)別正相關(guān);犬類(lèi)下頜骨最佳濃度約為人類(lèi)下頜骨1/2。由此可以推斷，兔下頜骨的用量應(yīng)該更少。根據(jù)本研究者測(cè)得，人體下頜骨體部的冠狀截面積約為2.7cm×1.2cm;兔本實(shí)驗(yàn)的截骨部位處截面積約為1.0cm×0.6cm，為前者的1/5.4。以此可以推斷，兔局部下頜骨截骨處的rhBMP－2用量應(yīng)該少于人的1/10。本研究中骨延長(zhǎng)的截骨間隙僅約2mm，而且兔下頜骨體部短小，僅能容納約2.0mg的rhBMP－2復(fù)合材料。該劑量約為廠商人體推薦用量的1/10，而且也有研究證實(shí)1.5mg的rhBMP－2完全能促進(jìn)新骨形成［11］。因此，術(shù)中同期置入量是合理的。

Wurzler等［3］研究還發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)大鼠放射后顱骨缺損的修復(fù)時(shí)，rhBMP－2劑量高效果較劑量低者好。在本部分研究中，兩組的新生骨沒(méi)有明顯的差別。是2.0mg rhBMP－2不足以促進(jìn)成骨?或者是rhBMP－2本身對(duì)放射后骨延長(zhǎng)新生骨的形成沒(méi)有促進(jìn)作用?這尚需要進(jìn)一步的研究。

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