繆 剛 李 堯 趙艷陽(yáng) 黃美雄 韋軍民

越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤中存在腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells)，并且其與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對(duì)化療不敏感關(guān)系密切。CD133被確認(rèn)為最好的獨(dú)立結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物，并且可以通過(guò)對(duì)結(jié)直腸癌CD133+細(xì)胞表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)患者的生存期［1］。這說(shuō)明CD133不但可以在篩選腫瘤干細(xì)胞以及靶向性或選擇性殺傷腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，還可以成為結(jié)直腸癌患者的一個(gè)重要預(yù)后指標(biāo)。本研究取材于手術(shù)中切除的新鮮結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，提取具有活性的原代結(jié)直腸癌單細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。在準(zhǔn)確定量評(píng)估后發(fā)現(xiàn)CD133+結(jié)直腸癌干細(xì)胞的表達(dá)與腫瘤增殖能力和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。這為臨床結(jié)直腸癌干細(xì)胞的準(zhǔn)確定量檢驗(yàn)提供了方法和依據(jù)。

材料與方法

1.腫瘤組織取材:結(jié)直腸癌組織直接來(lái)源于手術(shù)切取標(biāo)本(術(shù)前經(jīng)纖維結(jié)腸鏡活檢病理確認(rèn))。標(biāo)本離體后迅速切開(kāi)腸道，用0.9%生理鹽水沖洗后切取腫瘤邊緣約1cm×2cm大小非壞死組織。癌組織經(jīng)5次清洗液(青霉素1mg/ml、卡那霉素0.5mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml的生理鹽水)清洗后，存放入4℃保存液(5%FBS的DMEM，抗生素劑量同清洗液)備用。相關(guān)操作程序經(jīng)北京醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

2.原代結(jié)直腸癌細(xì)胞提取:腫瘤組織進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作臺(tái)。經(jīng)細(xì)胞清洗液(Hanks液，抗生素劑量同前)清洗3次后將組織剪碎，然后用刀片將組織切至稠液狀。將組織用9ml清洗液清洗收集入50m l離心管，加入1%collagenase 1ml (type I，Invitrogen corporation)后放入37℃培養(yǎng)箱震蕩消化60min。消化后組織液經(jīng)清洗離心，然后用60目篩網(wǎng)濾過(guò)后再次收集離心。離心后組織與10m l培養(yǎng)液(10%FBS的DMEM/F12，抗生素同前)混勻后放入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)Flask (collagen coated)過(guò)夜培養(yǎng)。第2天將上清懸浮細(xì)胞液吸除，保留貼壁活性細(xì)胞。用EGTA/Trypsin液將貼壁細(xì)胞游離收集后過(guò)120目篩網(wǎng)。細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后備用。

3.流式細(xì)胞計(jì)數(shù):應(yīng)用直接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。所用單克隆干、祖細(xì)胞單抗為CD133－PE。管中加入細(xì)胞1×106個(gè)/毫升，加入20μl CD133－PE熒光抗體。避光孵育20min后，加PBS混懸。采用FACScalibur(BD公司，美國(guó))流式細(xì)胞儀，應(yīng)用CELL－Quest軟件，每管獲取并分析105個(gè)細(xì)胞。

4.Western blotting:新鮮組織放入液態(tài)氮，研磨6～8次，直至細(xì)胞與生物重組基膜混合物粉碎融合。細(xì)胞裂解液包含Tris液(pH值7.4)、氯化鈉液、1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(roche applied science，德國(guó))的NP－40的緩沖液。全細(xì)胞裂解液蛋白濃度測(cè)定使用BCA試劑盒(Pierce)。蛋白質(zhì)通過(guò)SDS－PAGE電泳轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(Millipore)。使用以下抗體:caspase－3、e－cadherin和 GAPDH(Sigma－Aldrich，美國(guó))。蛋白斑點(diǎn)隨后與山葵過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(KPL，美國(guó))或抗兔抗山羊抗體(Santa Cruz)培養(yǎng)。蛋白質(zhì)的ECL檢測(cè)試劑盒的(Pierces)。

5.免疫組化:將10%甲醛固定包埋的結(jié)直腸癌標(biāo)本行4μm厚度連續(xù)切片，免疫組織化學(xué)方法采用非生物素二步法，常規(guī)免疫組織化學(xué)染色程序染色;其基本流程為:烤片－脫蠟和水化－抗原修復(fù)－免疫組織化學(xué)染色－復(fù)染、分化－封片－鏡檢、拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。由兩位病理醫(yī)師分別雙盲閱片。結(jié)直腸癌組織中P53和Ki－67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目判斷方法如下:每張玻片均選擇10個(gè)高倍視野;結(jié)果取10個(gè)視野的平均數(shù)。P53按照0～3評(píng)分，Ki－67按占總細(xì)胞百分比量化比較。

6.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):按照流式細(xì)胞定量評(píng)估結(jié)果，將CD133+腫瘤干細(xì)胞＜3%的病例分于A組，CD133+腫瘤干細(xì)胞≥3%的病例分于B組。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果分別在A、B兩組之間比較。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:運(yùn)用不成對(duì)t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.建立了具有可行性的原代結(jié)直腸癌單細(xì)胞提取體系:原代結(jié)直腸癌單細(xì)胞的提取需經(jīng)過(guò)取材(圖 1A)、消化過(guò)夜培養(yǎng)來(lái)確定貼壁的活性細(xì)胞(圖1B)、特異性染色(圖1C)和EGTA/Trypsin處理計(jì)數(shù)(圖1D)等幾個(gè)步驟。方法保證了所提取的腫瘤細(xì)胞接近100%，并且具有活性。雖然取材后的新鮮癌組織可在4℃保存液中保存1～3天，當(dāng)天取材后立即提取可得到最佳結(jié)果。一般手術(shù)取材多在中午或下午進(jìn)行，然后經(jīng)過(guò)2h左右操作可培養(yǎng)過(guò)夜。第二天操作時(shí)間約45min可得到備用細(xì)胞。提取過(guò)程一人操作，簡(jiǎn)明可行。

2.準(zhǔn)確定量評(píng)估癌組織中CD133+腫瘤干細(xì)胞:因?yàn)镃D133是造血干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白，研究首先將外周血單個(gè)核細(xì)胞作為參照對(duì)象和流式細(xì)胞儀單色設(shè)定參考(圖2A和B)。病例根據(jù)CD133檢測(cè)結(jié)果被分為A組(CD133+細(xì)胞＜3%)和B組(CD133+細(xì)胞≥3%)。A組CD133+細(xì)胞平均為1.7%，B組CD133+細(xì)胞平均為7.7%;A組平均腫瘤大小為27cm3，B組為32cm3;A組腸系膜淋巴轉(zhuǎn)移平均為0.7個(gè)，B組為2.4個(gè);A組腫瘤中P53平均表達(dá)為1.8分，B組為1.6分(表1)。

圖3 用免疫染色方法比較了兩組病例K i－67的表達(dá)

3.CD133的表達(dá)與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān):Ki－67是一種增殖抗原，主要定位于細(xì)胞核，與細(xì)胞周期密切相連，在有絲分裂中起著維持DNA有規(guī)則結(jié)構(gòu)的重要作用。腫瘤的增殖速度與預(yù)后密切相關(guān)。本研究中B組的Ki－67平均表達(dá)為74%，比A組的平均表達(dá)52%顯著增高(圖3)，說(shuō)明CD133+細(xì)胞增多的癌組織中腫瘤活性也增加了。e－cadherin在多數(shù)上皮細(xì)胞中有表達(dá)。作為一種與抑制腫瘤侵犯和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，e－cadherin在多數(shù)癌組織中表達(dá)下降。本研究中A組e－cadherin表達(dá)較B組增高，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase－3的表達(dá)在A組中增高(圖4)，這些說(shuō)明CD133+細(xì)胞增多的癌組織中抑制癌轉(zhuǎn)移的蛋白表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白也下降了。本研究還檢測(cè)了正常結(jié)直腸黏膜中CD133+細(xì)胞的比例。原代正常黏膜上皮細(xì)胞CD133+細(xì)胞為0.82% ± 0.64%(n=8)，比癌細(xì)胞低(3.06%±2.65%，n= 22，P＜0.05)。

圖4 用W estern blotting方法比較了兩組e－cadherin和caspase－3在癌組織和正常黏膜的表達(dá)

討論

CD133作為腫瘤中干細(xì)胞最重要的標(biāo)志物已經(jīng)多次被證實(shí)是結(jié)直腸癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，CD133表達(dá)率越高預(yù)示著患者的預(yù)后越差［1～5］。作為一種準(zhǔn)確而重要的評(píng)估方法，本研究首次提出直接從腫瘤中提取新鮮組織分離細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)得到CD133+細(xì)胞在腫瘤中的精確比例。這種方法與常規(guī)CD133免疫組化得到的結(jié)論會(huì)有很大的差別［2，3，6］。免疫組化染色的優(yōu)點(diǎn)是可以明確CD133+細(xì)胞在腫瘤中的定位。有報(bào)道顯示CD133+腫瘤細(xì)胞并沒(méi)有均勻分散在癌巢中，而是形成所謂的“熱點(diǎn)”，即CD133+腫瘤細(xì)胞通常聚集在一個(gè)癌巢或相鄰的幾個(gè)癌巢［4］。而同一張切片另外一些癌巢CD133+腫瘤細(xì)胞只有少數(shù)幾個(gè)或是根本沒(méi)有。因此，CD133+腫瘤細(xì)胞所占的比例很難通過(guò)若干張切片而準(zhǔn)確得出。本研究的方法是直接從腫瘤組織中提取原代新鮮細(xì)胞，這樣即可以保證所檢測(cè)的細(xì)胞100%為腫瘤細(xì)胞，又可以避免因?yàn)镃D133+腫瘤細(xì)胞分布差異而造成的評(píng)估誤差。

值得注意的是，CD133+腫瘤細(xì)胞≥3%的B組在腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)上都比CD133+腫瘤細(xì)胞＜3%的A組高。雖然研究的病例有限(23例)，但是表明了CD133+腫瘤細(xì)胞與不良預(yù)后相關(guān)的趨勢(shì)。尤其是在 Ki－67腫瘤增殖標(biāo)志物的比較中顯示CD133+細(xì)胞≥3%的結(jié)直腸癌增殖顯著性增高(圖3)。研究顯示在胃腺癌中，CD133+細(xì)胞的表達(dá)與Ki－67的表達(dá)正相關(guān)，并且預(yù)示著胃癌的最差預(yù)后［7］。CD133的表達(dá)還與腫瘤的大小和侵犯深度有關(guān)，這些都與本研究結(jié)果相符。CD133的表達(dá)與較短的生存期相關(guān)，這提示了CD133+腫瘤細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)對(duì)患者的預(yù)后意義重大［3］?；诎└杉?xì)胞假設(shè)，癌干細(xì)胞在常規(guī)治療后可能會(huì)通過(guò)自身更新和分化導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［8，9］。

雖然結(jié)直腸癌組織中CD133+細(xì)胞是否全部為腫瘤干細(xì)胞仍需要更深入的研究［10］，但是有證據(jù)顯示結(jié)腸癌組織CD133+細(xì)胞移植于裸鼠后具有更高的成瘤率［11］。Todaro等［12］將新鮮分離出的結(jié)直腸癌細(xì)胞注入裸鼠的皮下，發(fā)現(xiàn)其均可形成皮下腫瘤。然而通過(guò)免疫磁珠的方法將相同細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞徹底去除后，則發(fā)現(xiàn)腫瘤的形成明顯減少。將少量的純化結(jié)直腸癌CD133+細(xì)胞注入裸鼠中即可形成皮下腫瘤。這些研究表明CD133+細(xì)胞是結(jié)直腸癌組織中具有腫瘤干細(xì)胞特性的亞群，對(duì)結(jié)直腸癌的形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起決定性作用。因此，檢測(cè)CD133+細(xì)胞的量化比例是目前評(píng)估結(jié)直腸癌干細(xì)胞的有效方法之一。

本研究還揭示了結(jié)直腸癌中CD133的表達(dá)與抑制腫瘤侵犯相關(guān)蛋白e－cadherin的關(guān)系。在本研究CD133表達(dá)量高的結(jié)直腸癌中e－cadherin表達(dá)有下降的趨勢(shì)，說(shuō)明CD133在結(jié)直腸癌中的表達(dá)可能與腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移相關(guān)。另外，本研究顯示CD133表達(dá)量高的結(jié)直腸癌中caspase－3的表達(dá)下降，說(shuō)明了腫瘤細(xì)胞凋亡的減少，這與之前Ki－67增殖相關(guān)蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)規(guī)律相符?？傊?，CD133+結(jié)直腸癌干細(xì)胞的存在比例很可能預(yù)示著腫瘤的活性與侵犯和轉(zhuǎn)移能力，這進(jìn)一步說(shuō)明了準(zhǔn)確定量評(píng)估CD133+結(jié)直腸癌干細(xì)胞的重要性。

綜上所述，本研究成功建立了一套具有可行性的原代結(jié)直腸癌干細(xì)胞準(zhǔn)確定量評(píng)估系統(tǒng)。結(jié)直腸癌干細(xì)胞的準(zhǔn)確定量檢測(cè)可以作為評(píng)估患者預(yù)后和化療敏感度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本技術(shù)也為腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感試驗(yàn)，進(jìn)一步提純結(jié)直腸癌干細(xì)胞，和最終研究對(duì)癌干細(xì)胞靶點(diǎn)的攻擊提供了平臺(tái)。

1 Horst D，Kriegl L，Engel J，etal.Prognostic significance of the cancer stem cellmarkers CD133，CD44，and CD166 in colorectal cancer［J］.Cancer Invest，2009，27(8):844－850

2 尚立娜，楊愛(ài)軍，王晨昱，等.結(jié)直腸癌中CD133的表達(dá)與血管成相關(guān)性的研究［J］.腫瘤，2010，30(6):524－528

3 何向輝，羅宇東，盧蘭濤，等.結(jié)直腸癌組織CD133的表達(dá)及其意義［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15(2):120－123

4 Horst D，Kriegl L，Engel J，etal.CD133 expression is an independent prognosticmarker for low survival in colorectal cancer［J］.British Journal of Cancer，2008，99:1285－1289

5 李寶秀，張曉實(shí)，劉國(guó)龍.CD133在局部晚期結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)及意義［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(13):1678－1681

6 Takahashi S，Kamiyama T，Tomaru U，et al.Frequency and pattern of the stem cellmarker CD133 have strong prognostic effecton the surgical outcome of colorectal cancer patients［J］.Oncol Rep，2010，24 (5):1201－1212

7 Zhao P，Li Y，Lu Y，et al.Aberrant expression of CD133 protein correlateswith Ki－67 expression and is a prognosticmarker in gastric adenocarcinoma［J］.BMC Cancer，2010，10:218－224

8 Ieta K，Tanaka F，HaraguchiN，etal.Biological and genetic characteristics of tumor－initiating cells in colon cancer［J］.Ann Surg Oncol，2008，15:638－648

9 Verneulen L，Todaro M，de Sousa Mello F，et al.Single－cell cloning of colon cancer stem cells reveals amulti－lineage differentiation capacity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105:13427－13432

10 Labarge MA，BissellMJ.Is CD133 amarker ofmetastatic colon cancer stem cells?［J］.JClin Invest，2008，118(6):2021－2024

11 O'Brien CA，PollettA，Gallinger S，etal.A human colon cancer cell capable of initiating tumor growth in immunodeficientmice［J］.Nature，2007，445(4):106－110

12 Todaro M，Alea MP，Di Stefano AB，et al.Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin－4［J］.Cell Stem Cell，2007，1(4):389－402