李 華 龍潤鄉(xiāng) 楊 蓉 蔣蕊鞠 董承紅 易紅昆 白慧珠 謝忠平

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的重要的世界性傳染病之一，在中國人群的感染率達3.2%，其中50%～85%感染者發(fā)展為慢性丙型肝炎，10%～30%發(fā)展為肝硬化，肝硬化患者中約3% ～10%可演變?yōu)楦渭毎?］。HCV初發(fā)感染往往比較隱匿，僅有約20%～30%的感染者呈急性肝炎表現(xiàn)，所以選擇快速、靈敏、特異的檢測方法檢出HCV十分重要［2，3］。本研究應用HCV核心抗原試劑盒、HCV游離抗原試劑盒、丙型肝炎病毒(HCV)抗體檢測試劑盒(ELISA)及HCV核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒，對1551份血清或血漿臨床樣品檢測丙型肝炎病毒不同的標志物，現(xiàn)將結果報道如下。

材料與方法

1.材料:(1)血清或血漿標本來源:云南省第一人民醫(yī)院、昆明醫(yī)學院第一附屬人民醫(yī)院及云南省血液中心3個單位的血清或血漿樣品。(2)丙型肝炎病毒核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑:深圳匹基生物工程有限公司生產，批號20080702。(3)丙型肝炎病毒核心抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法):國內某公司上市產品，批號20091101。(4)丙型肝炎病毒抗體檢測試劑盒(ELISA):上海科華生物工程有限公司生產，批號200908011。(5)丙型肝炎病毒游離抗原檢測試劑盒(ELISA):中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所生產。

2.方法:(1)丙型肝炎病毒核酸擴增(PCR)熒光定量檢測:采用丙型肝炎病毒核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑，按試劑盒說明書進行熒光定量檢測。(2)丙型肝炎病毒核心抗原檢測:按試劑盒說明書進行ELISA檢測HCV－Ag。(3)丙型肝炎病毒抗體檢測:按試劑盒說明書進行 ELISA檢測HCV－Ab。(4)丙型肝炎病毒游離抗原檢測:包被HCV多表位復合抗原的多克隆抗體酶標板，先加入樣品緩沖液50μl，待檢樣品50μl，37℃孵育2h，洗板5次后，加酶結合物100微升/孔，37℃孵育1h。洗板5次后，加TMB顯色液，室溫顯色15min，于450nm波長檢測OD值。

結果

1.HCV不同標志物檢測結果分析:在1551份血清或血漿樣品中，共檢出HCV－Ab陽性樣品565份、HCV－Ag陽性樣品48份、HCV－RNA陽性樣品317份、HCV－CAg陽性25樣品。其中，HCV－Ab陽性樣品(陽性率36.43%)檢出率高于HCV－Ag陽性樣品(陽性率3.09%，χ2=543.422，P=0.000)、HCVCAg陽性樣品(陽性率1.61%，χ2=610.320，P= 0.000)及HCV－RNA陽性樣品(陽性率20.445%，χ2=97.437，P=0.000)，2種試劑檢出率皆顯示差異有統(tǒng)計學意義;HCV－Ag陽性樣品檢出率(3.09%)高于HCV－CAg陽性樣品(1.61%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.421，P=0.006); HCV－RNA陽性樣品(20.44%)檢出率高于HCVAg陽性樣品(3.09%)，2種試劑盒檢出率顯示差異有統(tǒng)計學意義(χ2=224.687，P=0.000);HCV－RNA陽性樣品(20.44%)檢出率高于HCV－CAg陽性樣品(1.61%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計學意義(χ2=280.203，P=0.000，表1)。

2.HCV－Ab指標相關性檢測結果分析:在565份HCV－Ab陽性樣品中，檢出48份HCV－Ag(游離抗原)陽性樣品，檢出率為8.50%;檢出23份HCV核心抗原(HCV－CAg)陽性樣品，檢出率為4.07%;檢出317份HCV－RNA陽性樣品，檢出率為56.11%。在984份全陰性樣品中，檢出2份HCV核心抗原(HCVCAg)陽性樣品，檢出率為0.20%;但未檢出HCV抗原及HCV－RNA(表2)。以上結果說明:HCV－RNA、HCV－Ag及HCV－CAg在HCV－Ab陽性樣品中的檢出率明顯高于HCV－Ab陰性樣品，具有明顯的關聯(lián)性。

表2 HCV抗原檢測試劑盒臨床研究不同性質樣品結果分析

3.兩種HCV抗原檢測試劑檢測結果分析:在317份HCV－Ab及HCV－RNA雙陽性的樣品中，HCV抗原檢測試劑檢出34份HCV游離抗原陽性樣品(陽性率10.73%)，HCV核心抗原檢測試劑檢出23份HCV核心抗原陽性樣品(陽性率7.26%)，HCV抗原檢測試劑檢出率高于HCV核心抗原檢測試劑，但2種試劑檢出率顯示差異無統(tǒng)計學意義(χ2= 2.333，P=0.1267)。

在248份HCV－Ab陽性、但HCV－RNA陰性的樣品中，HCV抗原檢測試劑檢出14份HCV游離抗原陽性樣品(陽性率5.65%)，HCV核心抗原檢測試劑未檢出陽性樣品(陽性率0)，2種試劑檢出率有明顯差異(χ2=14.407，P=0.0001)。

在984份HCV－Ab及HCV－RNA雙陰性的樣品中，HCV抗原檢測試劑未檢出陽性樣品(陽性率0)，HCV核心抗原檢測試劑檢出2份HCV核心抗原陽性樣品(陽性率0.20%)，2種試劑檢出率無明顯差異(校正χ2=0.501，P=0.479，表3)。

表3 2種HCV抗原檢測試劑對不同樣品檢測結果分析

4.HCV－Ab與HCV－RNA檢測結果關聯(lián)性分析:將本次所有樣品HCV－RNA(熒光定量PCR)與 HCV－Ab(ELISA)檢測結果進行分析，若以HCVRNA結果為金標準，則與用于HCV－Ab(ELISA)檢測結果一致性84.01%、靈敏度100.00%、特異度79.90%、陽性預測值 56.11%、陰性預測值100.00%。HCV－Ab(ELISA)檢出率(36.43%)明顯高于核酸檢出率(20.44%)。二者之間差異經配對t檢驗有顯著性(χ2=248.0，P=0.0000);對兩種檢測結果進行關聯(lián)度分析，兩種檢測結果明顯相關，其r =0.6696(χ2=691.9，P=0.0000)。若以HCV－Ab結果為金標準，則與HCV－RNA(熒光定量PCR)檢測結果一致性、靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值分別為84.01%、56.11%、100.00%、100.00%及79.90%。此結果提示，由于檢測原理及檢測的病毒標志物不同，熒光定量PCR與ELISA法檢測結果之間存在一定的差異，并不能完全吻合而取代，也許更重要的是相互補充(表4)。

表4 HCV－Ab與HCV－RNA檢測結果分析

討論

HCV感染的實驗室檢查是丙型肝炎診斷的重要依據(jù)，所以檢測方法的選擇非常重要。HCV感染通常是持續(xù)性的終生感染，抗體檢測是一個非常有效的方法，但由于存在“窗口期”及“靜默感染”，此期檢測不到相應的抗體，所以仍然有輸血后丙肝的發(fā)生［4～6］。國外資料報道ELISA法檢測HCV核心抗原比檢測HCV抗體縮短窗口期平均58.2天，僅比RT－PCR檢測HCV－RNA多0.24～3.33天，而抗體出現(xiàn)則比檢測到HCV－RNA晚28～140天［7］。反轉錄多聚酶鏈反應(RT－PCR)是一個很敏感的方法。HCV －RNA可以在暴露后的1～2周被檢出［8］。另外，在一些HCV感染后恢復期的人群中，抗HCV可能會逐漸降低到檢測限之下，或免疫功能低下的HCV感染者，抗HCV會持續(xù)陰性，這時，HCV－RNA的檢測是感染的唯一證據(jù)［9］。故使用RT－PCR技術檢測HCV－RNA是判斷感染最有效的方法。但其技術復雜、條件要求較高，不易在多數(shù)實驗室推廣。HCV抗原(HCV－Ag)包括核心抗原(HCV－CAg)、NS5、NS3及NS4等，是HCV感染者體內出現(xiàn)的早期感染標志，其消長趨勢與HCV－RNA有明顯的一致性，具有早期診斷的重要價值［7］。HCV－Ag或HCV－CAg的檢測有助于評價HCV在細胞中的表達情況。ELISA法較PCR法簡便、快速，其方法簡單、影響因素少、重復性好。因此，在不具備RNA檢測條件的實驗室開展HCV－CAg檢測或HCV－Ag檢測是很好的篩查方法。

本研究在1551份血清或血漿樣品中，共檢出HCV－Ab陽性樣品565份(陽性率為36.43%)、HCV－RNA陽性樣品317份(陽性率為20.445%)，2種試劑檢出率顯示差異有統(tǒng)計學意義(χ2=97.437，P =0.000)。HCV－RNA較HCV－Ab檢出率低，原因是由于本實驗采集的樣品部分為特殊樣品，且在HCV的3種標志物中，RNA不穩(wěn)定，而核酸的穩(wěn)定性較抗體差，導致在進行RT－PCR檢測時，樣品的檢出率降低［10，11］。

在317份HCV－Ab和HCV－RNA雙陽性樣品及984份HCV－Ab和HCV－RNA雙陰性樣品，HCV－Ag及HCV－CAg 2種標志物檢測結果檢出率差異皆無統(tǒng)計學意義，由此說明HCV－Ag檢測與HCVCAg檢測結果有高度的相關性。但在565份HCVAb陽性樣品中檢出48份 HCV－Ag(檢出率為8.50%)，23份HCV－CAg(檢出率為4.07%)，2種試劑檢出率有明顯差異(χ2=9.393，P=0.0022);在248份HCV－Ab陽性、但HCV－RNA陰性的樣品中，未檢測出HCV－CAg陽性樣品，而HCV抗原檢測試劑檢出14份，陽性率達5.65%，2種試劑檢出率有明顯差異(P=0.000)。可能是因為HCV－Ag檢測試劑所使用的抗體為HCV多表位復合抗原的多克隆抗體，除C表位外，尚有NS3、NS5等多個表位，相對于HCV核心抗原的單克隆而言，捕獲能力強、檢測靈敏度提高。

綜合比較分析，HCV的抗原、抗體及核酸標志物之間是相互關聯(lián)的，任何單一標志物的檢測均存在漏檢風險，HCV－CAg試劑與HCV－Ag試劑可作為HCV－Ab檢測的補充試劑，可聯(lián)合應用于臨床檢測及血源篩選，但其靈敏度有待提高［12］。

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2 楊朝國，陳川.丙型肝炎病毒感染的實驗室檢測及臨床應用［J］.國外醫(yī)學·臨床生物化學與檢驗學分冊，2004，25(4):379－381

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4 Legrer TJ，Riggert J，Simson G，et al.Testing of individual blood donations for HCV RNA reduces the residual risk of transfusion－transmitted HCV infection［J］.Transfusion，2000，40(10):192－197

5 Widell A，Molnegren V，Pieksma F，et al.Detection of hepatitis Core antigen inserum or plasma as a marker of hepatitis C viraemia in the serological window－phase［J］.Transfusion Med，2002，12(2):107－113

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7 Laperche S，Le Marrec N，Simon N，et al.A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes:an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection［J］.Transfusin，2003，43(7):958－962

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9 Alter HJ，Seeff LB.Recovery，persistence，and sequelae in hepatitis C virus infection:a perspective on long－term outcome［J］.Semin Liver Dis，2000，20(1):17－35

10 龍潤鄉(xiāng)，李華，崔萍芳，等.丙型肝炎病毒3種標志物的穩(wěn)定性［J］.中國生物制品學雜志，2009，22(5):468－469

11 劉長利，任芙蓉，呂秋霜，等.不同處理和保存條件下體外HCV RNA穩(wěn)定性研究［J］.中國實驗血液學雜志，2006，14(6):1238－1243

12 劉杰平，張賀平.丙肝病毒核心抗原與丙肝病毒抗體檢測的相關性［J］.海南醫(yī)學，2008，19(10):152－153