李化光 劉 華 孫 潔 楊新明 張林西 (河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075000)

利多卡因對體外培養(yǎng)人關節(jié)軟骨細胞凋亡的影響

李化光 劉 華1孫 潔 楊新明 張林西1(河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075000)

目的 通過檢測10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因干預后體外培養(yǎng)人關節(jié)軟骨細胞凋亡率的變化，探討短時間利多卡因對正常軟骨細胞是否有毒害作用。方法 正常人關節(jié)軟骨組織進行消化培養(yǎng)獲取軟骨細胞，分別用PBS、10 mg/ml利多卡因和20 mg/ml利多卡因處理24 h，然后利用流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡率。結果 10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因作用后都可使體外培養(yǎng)的軟骨細胞凋亡率明顯升高，同10 mg/ml利多卡因相比，20 mg/ml更能促進軟骨細胞凋亡。結論 利多卡因能夠導致體外培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞凋亡的增加，關節(jié)內(nèi)注射利多卡因有可能加速骨性關節(jié)炎發(fā)生，臨床應慎用。

利多卡因;軟骨細胞;細胞凋亡

骨性關節(jié)炎(OA)治療一般首選保守治療，包括口服藥物治療(主要是非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥和保護關節(jié)軟骨藥物)，肢體功能鍛煉治療以及關節(jié)內(nèi)注射藥物治療。局麻藥在臨床上常用來關節(jié)內(nèi)注射緩解OA患者的關節(jié)疼痛癥狀，另外許多關節(jié)外科醫(yī)生在關節(jié)鏡手術后也常規(guī)關節(jié)內(nèi)注射局麻藥緩解病人術后關節(jié)疼痛〔1〕;但是最近Chu等〔2〕報道0.5%布比卡因能夠使體外培養(yǎng)牛關節(jié)軟骨細胞凋亡增加，這提示局麻藥可能對軟骨細胞產(chǎn)生毒害作用，但許多局麻藥仍在臨床上大量使用，特別是關節(jié)內(nèi)注射利多卡因起效快，費用低廉，故仍在臨床廣泛應用，但利多卡因對體外培養(yǎng)關節(jié)軟骨凋亡的研究罕見，本實驗應用不同濃度利多卡因處理體外培養(yǎng)的人關節(jié)軟骨細胞，然后檢測軟骨細胞凋亡的變化，探討利多卡因是否能夠增加軟骨細胞凋亡，為臨床合理應用藥物治療OA提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養(yǎng)液，Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司)凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。美國FACSAria流式細胞儀。關節(jié)軟骨標本取自無OA病史接受截肢手術患者的股骨內(nèi)側髁關節(jié)軟骨7例，男6例，女1例，年齡25～36歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代軟骨細胞的分離 成年人關節(jié)軟骨細胞(AHAC)的分離培養(yǎng)：無菌取右下肢毀損傷患者截肢右股骨髁關節(jié)軟骨，剪碎，加人10倍體積0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃攪拌消化3～4 h，離心，沉淀用含20%FBS軟骨細胞培養(yǎng)基稀釋，按2×105/ml接種到 50 ml培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，常規(guī)按 1∶2傳代培養(yǎng)。傳2代細胞用于實驗。

1.2.2 分組 傳代后的軟骨細胞被分為3組：第一組為對照組，向培養(yǎng)皿內(nèi)軟骨細胞加入1 ml PBS，第二組加入1 ml利多卡因(10 mg/ml)，第三組加入1 ml利多卡因(20 mg/ml)，分別作用24 h，收集細胞，然后按照試劑盒說明將各組細胞染色標記，應用流式細胞儀分別檢測細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

同對照組相比，10 mg/ml和20 mg/ml利多卡因作用后體外培養(yǎng)軟骨細胞凋亡率明顯增加〔(15.07±1.21)%、(19.74±2.70)%vs(1.62±0.47)%，P＜0.05〕，PBS干預24 h后測定軟骨細胞凋亡率僅為1.5%，而10 mg/ml利多卡因作用24 h后軟骨細胞凋亡率為15%，20 mg/ml利多卡因干預24 h后軟骨細胞凋亡率為19%。

3 討論

聯(lián)合應用關節(jié)內(nèi)注射局麻藥和糖皮質激素類藥物一般能夠迅速減輕OA患者疼痛癥狀，改善生活質量，其不足之處是持續(xù)時間較短，一般不超過3個月，此外長期應用糖皮質激素類藥物還可導致關節(jié)軟骨早期發(fā)生蛻變，導致OA，故臨床上對應用糖皮質激素類藥物目前已經(jīng)非常謹慎，但對應用局麻藥是否對關節(jié)軟骨有毒害作用的研究還非常罕見，有學者研究表明局麻藥對神經(jīng)細胞、肌細胞等多種細胞具有細胞毒作用〔3，4〕，而通常認為細胞壞死是通過細胞膜的破裂發(fā)生的，而線粒體膜的破裂往往導致細胞發(fā)生凋亡。有學者發(fā)現(xiàn)細胞周圍的高度脂溶性的局麻藥極易到達線粒體進而導致線粒體膜的破裂，而一旦局麻藥清除后細胞內(nèi)線粒體膜具有自我修復傾向〔5〕，凋亡是一種高度程序化的細胞自殺行為，是機體正常發(fā)育過程中清除無用細胞的生理機制。然而凋亡也經(jīng)常參與疾病的病理過程〔6〕。許多研究發(fā)現(xiàn)軟骨細胞的凋亡與OA的病理機制有關。對分離的軟骨細胞以及對軟骨組織原位研究顯示在OA關節(jié)軟骨中發(fā)生了大量的軟骨細胞凋亡〔7〕。研究表明OA患者關節(jié)軟骨蛻變和凋亡存在一定相關性〔8〕。一般認為這主要是因為軟骨組織自身特點導致，軟骨組織中無巨噬細胞，因此軟骨細胞發(fā)生凋亡后凋亡小體不能被巨噬細胞清楚，凋亡小體釋放的蛋白水解酶就會對細胞外基質造成不可逆的損害，而關節(jié)軟骨自我修復能力極為有限，如果大量軟骨細胞發(fā)生凋亡后軟骨細胞周圍細胞外基質成分將大量缺失，而細胞外基質成分對維持關節(jié)軟骨組織穩(wěn)定性至關重要，因此，任何關節(jié)內(nèi)注射后能夠導致軟骨細胞發(fā)生凋亡的藥物將加速OA的發(fā)生。本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著利多卡因濃度的增加，體外培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞的凋亡率也隨著增高。

本實驗認為關節(jié)內(nèi)注射局麻藥治療OA應慎重，即使應用也應小劑量、低濃度短期應用，否則有可能對關節(jié)軟骨產(chǎn)生毒害作用，誘發(fā)OA。當然，本研究還存在一定局限性：首先，本實驗檢測的是體外培養(yǎng)關節(jié)軟骨細胞的凋亡變化，而軟骨細胞在消化及體外培養(yǎng)過程中不能全部存活，并且體外培養(yǎng)的懸浮細胞不能完全反應復雜、高度分化的軟骨組織，所以利多卡因在體外培養(yǎng)細胞中的擴散同在軟骨組織中的擴散也不盡相同;其次，本實驗只檢測了利多卡因這一臨床常用的局麻藥物，如果檢測其他不同局麻藥物，也可能會有不同結果，還需進一步確定不同濃度及作用時間的不同類型局麻藥對關節(jié)軟骨細胞凋亡的影響。

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5 Blanco FJ，Guitian R，Vazquez-Martul E，et al.Osteoarthritis chondrocytes die by apoptosis：a possible pathway for osteoarthritis pathology〔J〕.Arthritis Rheum，1998;41(2)：284-9.

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R684.3

〕 A 〔

1005-9202(2012)22-4952-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.045

河北省教育廳科學研究計劃項目(No.Z2010224);張家口市科技局科學研究與發(fā)展指導計劃(No.0801006D)

1 河北北方學院生命科學研究中心

張林西(1968-)，男，教授，碩士生導師，主要從事病理學研究。

李化光(1976-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨外科學研究。

〔2011-10-26收稿 2012-01-12修回〕

(編輯 曹夢園)