楊宇杰，呂英超，于海龍，耿榕徽，郭金甲，楊冬麗，鄭艷春，王春民

(1.承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德067000;2.承德頸復康藥業(yè)集團有限公司，河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北承德067000)

頸復康顆?，F(xiàn)收載于《中國藥典》2010年版(一部)，處方由羌活、川芎、葛根、秦艽、蒼術(shù)、乳香、沒藥、地龍、桃仁等二十一味中藥組成，具有活血通絡(luò)，散風止痛功能?，F(xiàn)有研究資料表明，頸復康顆粒中川芎、羌活、蒼術(shù)、乳香、沒藥等藥材中的揮發(fā)油類成分是其主要有效部位之一，具有止痛、抗炎、活血化瘀等藥理作用［1-4］。目前，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分的藥理作用研究尚未見報道。本實驗對頸復康顆粒中揮發(fā)油成分的抗炎、鎮(zhèn)痛作用進行了評價研究，并初步探討其作用機制，為開展頸復康顆粒的藥物作用物質(zhì)基礎(chǔ)的技術(shù)評價提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物昆明種小鼠，18～22 g，天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供，許可證號:SCXK(津)2009-0001。SD大鼠，160～180 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2009-0004。

1.2 藥品與試劑

頸復康顆粒揮發(fā)油，承德頸復康藥業(yè)集團有限公司提供，批號20111101。制備方法:取川芎、蒼術(shù)、乳香、沒藥、羌活五味藥材，按頸復康顆粒處方比例配藥，破碎成粗粉，回流法提取揮發(fā)油，提取率13.9 mL/kg生藥。實驗時用1%吐溫80稀釋到各實驗組相應(yīng)濃度給藥。

頸復康顆粒，承德頸復康藥業(yè)集團有限公司提供，批號20111005;角叉菜膠，上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號:110218;白介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)試劑盒，上海森雄科技實業(yè)公司產(chǎn)品。

1.3 儀器YLS-6B智能熱板儀，濟南益延科技發(fā)展有限公司;752N紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響［5］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，隨機分為頸復康顆粒中揮發(fā)油成分組［70 g生藥/(kg·d)］、頸復康顆粒中揮發(fā)油成分組［35 g生藥/(kg·d)］，頸復康顆粒組［12 g/(kg·d)］及空白對照組，每組10只小鼠。各組連續(xù)口服給藥7 d(給藥容積0.2 mL/10 g，空白對照組給予等容積1%吐溫80)。末次給藥1 h后，各鼠右耳滴20 μL二甲苯致炎，2 h后處死動物，剪下左右兩耳，用直徑6 mm打孔器在左右對稱部位沖下耳片，稱質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量差值表示炎性腫脹程度，各組腫脹抑制率=(對照組腫脹度－各組腫脹度)/對照組腫脹度，結(jié)果見表1。以下數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。

如表1所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組均能顯著抑制小鼠耳腫脹。

表1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

表1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.001;與頸復康顆粒組比較，★P＜0.05。

組別劑量/(g·kg－1)腫脹度/mg抑制率/%－7.10±0.89－頸復康顆粒組12 4.67±0.83*34.23頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組空白對照組29.58 70 4.32±1.05*39.15頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 5.00±1.05*

2.2 對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管滲出的影響［6］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min，每只小鼠尾靜脈注射0.5%的伊文思藍生理鹽水溶液0.2 mL，隨后立即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，20 min后處死小鼠，輕揉腹部30 s，5 min后剖開腹腔，用適量生理鹽水反復沖洗，并收集洗出液，濾紙濾過，并調(diào)整容積至6 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液，于分光光度計590 nm波長處測定吸光度，進行統(tǒng)計學檢驗，結(jié)果見表2。

表2 對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管滲出的影響(±s，n=10)

表2 對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管滲出的影響(±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與頸復康顆粒組比較，△P＜0.05。

組別劑量/(g·kg－1)吸光度(A)抑制率/%－0.429±0.066－頸復康顆粒組12 0.347±0.048＊＊19.1頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組空白對照組12.6 70 0.330±0.052＊＊23.1頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 0.375±0.046*

如表2所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組小鼠腹腔毛細血管滲出液的吸光度均明顯低于空白對照組，與空白對照組比較具有顯著性差異。

2.3 對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響［7］取SD大鼠32只，雌雄各半，160～180 g，隨機分成4組，每組8只，分組情況同上。按表3所示劑量每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥后30 min，在大鼠右后足皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL致炎。分別在致炎前和致炎后0.5、1、2、4 h測量足容積，以致炎前后不同時間點的腫脹差值表示腫脹度。測量后處死動物，截取右后足，稱質(zhì)量，冰浴條件下剪碎、勻漿，按所購試劑盒的操作步驟測定IL-1、TNF-α和PGE2水平，進行統(tǒng)計學檢驗。結(jié)果見表3、表4。

表3 對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響(±s，n=8)

表3 對角叉菜膠所致大鼠足腫脹的影響(±s，n=8)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

0.5 h 1.0 h 2.0 h 4.0 h空白對照組組別(g·kg－1)0.67±0.07 0.95±0.19 1.19±0.26 0.91±0.14頸復康顆粒組12 0.41±0.16＊＊0.56±0.12＊＊＊0.76±0.15＊＊0.64±0.17＊＊頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 0.38±0.10＊＊＊0.61±0.16＊＊0.79±0.05＊＊0.56±0.08＊＊＊頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 0.49±0.07＊＊＊0.70±0.05＊＊△0.93±0.14＊△△0.69±0.09－＊＊

表4 對大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平的影響(±s，n=8)

表4 對大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平的影響(±s，n=8)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別劑量/(g·kg－1)IL-1/(pg·mL－1)TNF-α/(pg·mL－1)PGE2/(pg·mL－1)126.40±17.14 478.35±31.58 49.67±7.11頸復康顆粒組12 68.99±15.47＊＊＊397.02±36.84＊＊＊34.70±8.71＊＊頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 69.54±15.74＊＊＊384.70±31.07＊＊＊39.63±5.25＊＊頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 93.87±12.52＊＊＊△△443.48±33.56＊△△43.35±4.30空白對照組－＊△

如表3所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組給藥后4 h均對大鼠足腫脹有非常顯著的抑制作用，抑制作用時間較長，與空白對照組比較具有顯著性差異。

如表4所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組均可明顯降低大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α和PGE2水平，與對照組比較差異具有顯著性。

2.4 對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響［8］昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min，腹腔注射0.7%的醋酸溶液0.1 mL/10 g，5 min后記錄給藥后36～45 min，46～55 min，56～65 min，66～75 min內(nèi)每只小鼠的扭體次數(shù)，進行統(tǒng)計學檢驗，結(jié)果見表5。各組對小鼠扭體反應(yīng)的抑制率=(對照組扭體次數(shù)－各組扭體次數(shù))/對照組扭體次數(shù)。

如表5所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組均能明顯減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與空白對照組比較差異具有顯著性。

2.5 對小鼠熱板法致痛的影響［9］小鼠熱板法:實驗時，把小鼠放到預先加熱至55℃的恒溫金屬銅板上，以舔后足為痛反應(yīng)指標。實驗動物均為雌性、基礎(chǔ)痛閾在30 s內(nèi)的小鼠(藥前間隔5 min測得小鼠兩次痛反應(yīng)潛伏期，以兩次的均值作為基礎(chǔ)痛閾)。痛閾提高百分率=(各組給藥后痛反應(yīng)潛伏期-給藥前痛反應(yīng)潛伏期)/給藥前痛反應(yīng)潛伏期。

昆明種小鼠40只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，分組及給藥方法同前。末次給藥后30 min開始觀察記錄痛反應(yīng)潛伏期，進行統(tǒng)計學檢驗，結(jié)果見表6。

如表6所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組小鼠舔后足時間均明顯延長，與空白對照組比較差異具有顯著性。

2.6 對大鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響［10］SD大鼠32只，雌雄各半，160～180 g，隨機分成4組，每組8只，分組及給藥情況同上。于給藥前及末次給藥后0.5、1、2、3 h分別將大鼠尾尖2 cm浸入恒溫水浴中(55±0.5)℃，記錄鼠尾自浸入水中到出現(xiàn)甩尾動作的時間，作為甩尾潛伏期。將給藥各組的平均甩尾潛伏期與對照組平均甩尾潛伏期比較，進行統(tǒng)計學檢驗。結(jié)果見表7。

表5 對小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

表5 對小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

注:表中()內(nèi)數(shù)字為抑制率(%);與空白對照組比較，*P＜0.001;與頸復康顆粒組比較，△P＜0.05，△△P＜0.001。

給藥后不同時間內(nèi)扭體反應(yīng)數(shù)/(次·10 min)36～45 min 46～55 min 56～65 min 66～75 min空白對照組組別給藥劑量/(g·kg－1)－51.5±6.45 42.4±5.21 38.4±3.86 32.0±4.29頸復康顆粒組12 28.3±3.37*(45.0)14.0±4.27*(56.3)頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組70 29.7±3.59*(42.3)18.8±3.55*(55.7)19.3±4.11*(49.7)15.2±4.26*(52.5)頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組35 39.2±2.90＊△△(23.9)22.6±2.46*(46.7)19.6±3.84*(49.0)30.6±2.99＊△△(27.8)27.6±3.84＊△△(28.1)22.1±3.90＊△△(30.9)

表6 對小鼠熱板法致痛的影響(±s，n=10)

表6 對小鼠熱板法致痛的影響(±s，n=10)

注:表中()內(nèi)數(shù)字為痛閾提高百分率(%);與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001;與頸復康顆粒組比較，△P＜0.05。

痛反應(yīng)潛伏期60 min空白對照組－14.92±2.97 15.26±2.96 14.73±2.72 14.83±2.組別給藥劑量/(g·kg－1)/s給藥前給藥后30 min給藥后40 min給藥后50 min給藥后61 15.02±2.39頸復康顆粒組12 15.20±3.26 20.94±3.05＊＊(37.2)20.44±3.54＊＊(36.1)頸復康顆粒揮發(fā)油成分高劑量組23.33±5.64＊＊＊(58.4)22.57±4.93＊＊＊(52.2)21.85±4.27＊＊＊(45.5)頸復康顆粒揮發(fā)油成分低劑量組70 15.04±3.25 19.91±3.56＊＊(30.5)22.63±4.90＊＊＊(53.6)22.77±4.26＊＊＊(53.5)35 14.91±3.62 17.78±3.28△(16.5)20.03±3.14＊＊(36.0)18.84±3.05＊＊(27.0)17.86±3.33*(18.9)

表7 對大鼠溫浴甩尾反應(yīng)的影響(x±s，n=8)

如表7所示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分高低兩個劑量組均可明顯延長大鼠甩尾反應(yīng)時間，與空白對照組比較差異具有顯著性。

3 討論

抗炎實驗結(jié)果顯示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分對上述3種實驗性炎癥模型具有非常顯著的抗炎作用。揮發(fā)油高低兩個劑量組對小鼠耳腫脹的抑制率分別為39.15%、29.58%。對大鼠足腫脹有非常顯著的抑制作用，藥物作用的達峰時間在2 h左右，但作用持續(xù)時間可達4 h以上，在致炎后4 h與對照組比較仍有非常顯著的差異。對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管滲出的結(jié)果表明揮發(fā)油能夠明顯減少炎性滲出物的產(chǎn)生。

鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果顯示，頸復康顆粒中揮發(fā)油成分能夠非常明顯地提高化學刺激、溫熱刺激所引起疼痛的痛閾值。揮發(fā)油高低兩個劑量組對小鼠扭體反應(yīng)的抑制率分別為42.3%～52.5%、23.9%～30.9%。對小鼠熱板法痛閾提高百分率分別為30.5%～53.6%、16.5%～36.0%，顯示出較強的鎮(zhèn)痛效果。溫浴甩尾實驗結(jié)果表明，揮發(fā)油具有起效快、持續(xù)時間長的特點，藥后0.5 h即顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用，且能持續(xù)到3 h以上。

TNF-α、IL-1均為重要的炎癥介質(zhì)，低水平時主要在炎癥的局部起作用，對中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞有激活趨化作用。PGE2是活性較強的一種炎癥介質(zhì)和疼痛介質(zhì)，可擴張小血管、增加微血管的通透性、吸引中性粒細胞，促進炎癥反應(yīng)及組織損傷，并能增強組胺、5-羥色胺、緩激肽等其他炎癥、疼痛介質(zhì)的協(xié)同作用［11-12］。

頸復康顆粒中揮發(fā)油高低兩個劑量組均可顯著降低大鼠腫脹足中IL-1、TNF-α及PGE2水平，提示其抗炎鎮(zhèn)痛作用與降低IL-1、TNF-α及PGE2水平有關(guān)。

本項實驗研究初步證實了揮發(fā)油類成分具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且起效快、作用持續(xù)時間長，是頸復康顆粒的主要有效部位之一，提示應(yīng)對頸復康顆粒中揮發(fā)油成分提取的生產(chǎn)工藝進行深入研究，盡可能增加揮發(fā)油提取率和制劑固體化率，并開展頸復康顆粒中揮發(fā)油類指標成分的含有量測定方法研究，制定相關(guān)成分含有量標準，提高產(chǎn)品的質(zhì)量可控性，從而進一步保障產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效。

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