程夏倩，張文婷，程維明，趙維良*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053;2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州310004)

冠脈寧片由丹參、血竭、葛根等十四味中藥組成，功能活血化瘀，行氣止痛，常用于以胸部刺痛、固定不移等為主癥的冠心病，心絞痛，冠狀動脈供血不足［1］。該品全國共有25家企業(yè)生產(chǎn)，11個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有單獨控制葛根素或丹參素量或無定量控制。葛根素是葛根的主要有效成分之一，具有改善心腦血管循環(huán)、降低心肌耗氧量等多種藥理作用［2］。因此控制葛根素的含有量可以保障有效性的同時也可以從另一方面控制葛根的植物來源。丹參酚酸類成方是丹參主要有效成分，具有抗脂質(zhì)過氧化、抗血栓、改善血液循環(huán)等作用［3］，其中丹酚酸B量最高，且活性最強(qiáng)，選擇測定丹酚酸B作為質(zhì)量控制指標(biāo)具有重要意義;且《中國藥典》［4］中，丹酚酸B也是丹參藥材質(zhì)量控制指標(biāo)之一。目前對葛根素、丹酚酸B等成分研究文獻(xiàn)有較多報道［5-12］，本實驗建立了RP-HPLC法同時測定冠脈寧片中的葛根素和丹酚酸B，可為冠脈寧片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器HP1100系列高效液相色譜儀(G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1313A自動進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器，Chemstation色譜工作站)。

1.2 試藥葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號725-200108，定量測定用)，丹酚酸B對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111562-200605，定量測定用)，甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。冠脈寧片由12家生產(chǎn)企業(yè)提供共25批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫，洗脫條件見表1;檢測波長:286 nm;柱溫:40℃;體積流量:1.0 mL/min。進(jìn)樣量:對照品10 μL、供試品10 μL，理論板數(shù)按葛根素峰計算大于3 000。在此色譜條件下能達(dá)到很好分離，缺味樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

圖1 冠脈寧片HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Guanmaining Tablets

2.2 對照品溶液制備精密稱取葛根素和丹酚酸B對照品適量，加50%甲醇分別制成每1 mL各含約95.95 μg和45.04 μg的對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備取本品10片(包衣者除去包衣)，研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加50%甲醇適量，浸漬30 min后超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備分別取缺葛根藥材和缺丹參藥材的片劑，按照2.3項供試品溶液的制備方法制成陰性對照樣品。

2.5 線性關(guān)系考察精密吸取上述葛根素對照品溶液0.5、1、2、4、8、12、20 μL進(jìn)樣，上述丹酚酸B對照品溶液1、2、4、8、12、20、30、40 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以色譜峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，計算回歸方程，葛根素的線性方程為Y=1.349 8X+1.862 5，r=1.000 0，丹酚酸B的線性方程為Y=1.084 6X－7.048 8，r=1.000 0，說明葛根素在進(jìn)樣量0.048～1.919 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，丹酚酸B在進(jìn)樣量0.045～1.801μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗精密吸取葛根素和丹酚酸B對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果葛根素峰面積的RSD為0.2%，丹酚酸B峰面積的RSD為0.5%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗取同一批樣品(廠家12，批號:091101)6份，按供試品溶液制備方法制備，結(jié)果葛根素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.66 mg/g，RSD為0.4%，丹酚酸B平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.63 mg/g，RSD為0.8%。

2.8 回收率試驗精密稱取樣品(廠家12，批號:091101)6份，分別精密加入葛根素對照品溶液和丹酚酸B對照品溶液適量，按正文供試品制備法制備，并依法測定，結(jié)果見表2，葛根素平均回收率為99.8%，RSD為1.5%，丹酚酸B平均回收率為108.8%，RSD為1.1%。

表2 冠脈寧片的加樣回收試驗結(jié)果Tab.2 Recovery test results of Guanmaining Tablets

2.9 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一份供試品溶液和對照品溶液，在32 h內(nèi)，每間隔1、3、11、17個小時進(jìn)樣1次，進(jìn)樣體積為10 μL，結(jié)果對照品葛根素峰面積RSD為0.2%、供試品溶液為0.4%;對照品丹酚酸B峰面積RSD為0.4%、供試品溶液為0.5%，表明供試品溶液和對照品溶液在32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 樣品測定對收集到樣品的12家生產(chǎn)企業(yè)共25批冠脈寧片按擬定的方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 冠脈寧片樣品測定結(jié)果(n=2)Tab.3 Content determ ination of Guanmaining Tablets(n=2)

3 討論

3.1 本實驗考察了回流、超聲等提取方法，根據(jù)化合物的性質(zhì)，選擇50%甲醇為溶劑，由于丹參為水煎煮提取，葛根為生粉入藥，故選擇浸漬30 min后超聲提取30 min和回流提取30 min兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果葛根素量相當(dāng)，丹酚酸B用回流提取略低，考慮丹酚酸B對熱的不穩(wěn)定性，確定提取方法為超聲提取。此外，通過對溶媒種類(30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇)、超聲時間、溶液量等因素進(jìn)行考察，最后確定樣品的制備選擇取0.25 g樣品加25 mL 50%甲醇超聲提取30 min，該方法操作簡便易行，且避免成分損失。

3.2 本實驗中，比較了乙腈－0.005%三氟乙酸溶液、乙腈－0.05%磷酸溶液、乙腈－甲醇－0.05%磷酸溶液為流動相及不同洗脫條件，考察被測組分與雜質(zhì)峰的分離情況，最后選擇乙腈-甲醇-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫分離度好;比較了Agilent Extend－C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Therm Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種色譜柱對樣品進(jìn)行測定，3種色譜柱所測得的樣品含有量偏差在3.0%以內(nèi)且3種色譜柱都有較好的分離度，同時還比較了20℃、30℃、40℃的柱溫對樣品進(jìn)行分析，不同柱溫下均有較好的分離且對含有量測定結(jié)果影響不大，葛根素RSD為2.3%，丹酚酸B RSD為1.1%。

3.3 檢測波長的選擇本實驗采用DAD檢測器對葛根素及丹酚酸B的吸收波長進(jìn)行了全面的考察，葛根素最大吸收波長為250 nm、305 nm，丹酚酸B的最大吸收波長為286 nm，考慮丹酚酸B相對于葛根素量較低，且在丹酚酸B最大吸收波長處葛根素也能得到較好的分離，能完全滿足定量測定的要求，故確定測定波長286 nm。

3.4 樣品測定結(jié)果分析測定結(jié)果顯示同一企業(yè)的不同批號產(chǎn)品測定結(jié)果差異較小，但不同企業(yè)產(chǎn)品差異大。廠家3中葛根素含量最高，為10.29 mg/片;廠家8中葛根素含量最低，為0.59 mg/片;廠家2中丹酚酸B含量最高，達(dá)13.68 mg/片;廠家5中丹酚酸B含量最低，為0.53 mg/片。不同企業(yè)產(chǎn)品的葛根素含量差異大的原因可能與各企業(yè)投料的原藥材品種有關(guān)，12家生產(chǎn)企業(yè)中，4家使用粉葛投料，8家使用野葛投料，使用粉葛的廠家平均值為0.61 mg/片，而使用野葛的廠家平均值為3.09 mg/片，相差五倍之多。丹酚酸B含量測定結(jié)果相差較大的原因推測可能與丹酚酸B的不穩(wěn)定性以及生產(chǎn)工藝中加熱的參數(shù)不同有關(guān)。溫度、受熱時間、pH都是影響其穩(wěn)定性的重要因素［9］。因此，為避免市場流通的冠脈寧片不同廠家的質(zhì)量差異較大，建議各生產(chǎn)企業(yè)通過實驗考察，細(xì)化工藝參數(shù)，量化成品指標(biāo)，從而有效控制冠脈寧片的質(zhì)量。

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第十冊)［S］.1995:122.

［2］白群華，李文明，劉洪清，等.葛根素對脂多糖誘導(dǎo)NG小膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用［J］.細(xì)胞與分子免疫雜志，2010，26(3):27-230.

［3］杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20(5):394.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］鄭巍.高效液相色譜法測定冠脈寧片中葛根素的含量［J］.山西中醫(yī)，2010，26(5):50-51.

［6］馮慧，周青，謝繼安.HPLC譜法測定葛粉中葛根素含量［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，17(3):57-59.

［7］蔣珍藕，蘭寶強(qiáng)，邱宏聰，等.HPLC法測定精制冠心片中丹酚酸B的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17(1):83-85.

［8］曾江洪，劉燦輝.HPLC法測定再生片中丹酚酸B的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，1(3):95-96.

［9］朱金墻，閆晨，康立源.丹酚酸B的穩(wěn)定性及其降解機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(12):113-115.

［10］張雪慧.HPLC法測定冠脈寧顆粒中丹參素鈉的含量［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2008，28(1):60-61.

［11］劉必旺，李會芳，趙換，等.HPLC與TLC測定復(fù)方葛根膠囊中葛根素含量［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(4):695-697.

［12］劉文斌，閻琪.高效液相色譜法測定川葛顆粒中葛根素的含量［J］.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2011，10(1):71-72.