馬志英

(西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730030)

清肺抑火片由黃芩、梔子、黃柏、大黃、苦參、天花粉、知母、桔梗、前胡組成，具有清肺止嗽，降火生津功能，主治肺熱咳嗽，痰延壅盛，咽喉腫痛，口鼻生瘡，牙齒疼痛，牙根出血，大便干燥，小便赤黃［1］。其中黃芩苷、梔子苷、小檗堿及大黃素量高低直接影響清肺抑火片的藥效［2-7］。

雖有HPLC法測(cè)定清肺抑火片中大黃素、梔子苷或黃芩苷成分的報(bào)道［8-9］，但同時(shí)測(cè)定其梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿及大黃素的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)同時(shí)測(cè)定清肺抑火片中梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿及大黃素4種有效成分的方法。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性和精密度均良好，適用于同時(shí)測(cè)定清肺抑火片中梔子苷、黃芩苷、小檗堿及大黃素4種成分，為清肺抑火片的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀(配置真空脫氣機(jī)G1322A、四元泵G1311A、自動(dòng)進(jìn)樣器G1329A、二級(jí)管陣列檢測(cè)器DAD，G1315B);ZORBX Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品;AS3120型超聲波清洗器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品;梅特勒AB204-S標(biāo)準(zhǔn)型分析天平，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品。

1.2 試藥梔子苷對(duì)照品(批號(hào):110749-20010)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):110715-201016)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713-200609)和大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-200110)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;清肺抑火片(修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格:0.6 g/片，批號(hào):091107，100618，101156);乙腈為色譜純;甲醇、磷酸為分析純;水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱:E-clipse XDB-C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);柱溫:30℃;波長(zhǎng):240 nm(梔子苷)，278nm(黃芩苷，鹽酸小檗堿，大黃素);體積流量1.00 mL/min。;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:乙腈-0.2%磷酸水溶液(體積比)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。理論板數(shù)按黃芩苷計(jì)算不低于5 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 M obile phase elution procedure

2.2 實(shí)驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液精密稱取梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素對(duì)照品各適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量并超聲30 min溶解，放冷至室溫，用甲醇定容，制得質(zhì)量濃度分別為0.460 0 mg/mL、0.930 0 mg/mL、0.430 0 mg/mL、0.360 0 mg/mL的梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素對(duì)照品貯備液。精密吸取上述4種對(duì)照品貯備液各適量，置同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容、搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得含梔子苷0.036 8 mg/mL、黃芩苷0.074 4 mg/mL、鹽酸小檗堿0.038 7 mg/mL、大黃素0.057 6 mg/mL的對(duì)照品混合溶液。

2.2.2 樣品溶液取樣品15片，置研缽中研細(xì)混合均勻，精密稱定約0.2 g，置具塞三角燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲溶解30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液依照清肺抑火片的處方比例和生產(chǎn)工藝，取缺梔子、黃芩、黃柏、大黃的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液、2.2.2項(xiàng)下供試品溶液、2.2.3項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在此條件下供試品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素色譜峰與他們各自相鄰色譜峰的分離度不低于1.6，理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì)不低于5 000，陰性對(duì)照溶液在對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間未出現(xiàn)色譜峰，表明本法專屬性強(qiáng)。色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 雙檢測(cè)波長(zhǎng)下4成分混合對(duì)照品溶液的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of standards solution at dual detection wavelengths

圖2 雙檢測(cè)波長(zhǎng)下供試品和陰性對(duì)照品溶液的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of samp le solutions and negative control solutions at the dual detection wavelengths

2.4 方法的線性范圍精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液0.5、1、2、3、5、7、9、10 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，得梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的回歸方程分別為Y=1 535.5X+1.115 3(r=0.9998)、Y=2 909.3X+7.017 6(r=0.999 8)、Y=1 315.1X+3.442 9(r=0.999 9)、和Y=2 028.1X－32.383，(r=0.999 8)，線性范圍分別為0.036 8～0.331μg、0.074 4～0.670μg、0.038 7～0.348 μg和0.057 6～0.518 μg。結(jié)果表明，梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿與大黃素4種組分的進(jìn)樣量與其峰面積積分值線性關(guān)系良好。

2.5 方法的最低檢測(cè)限取混合對(duì)照品溶液逐步稀釋后，注入高效液相色譜儀，以峰高為基線噪音3倍計(jì)，梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素的最低檢測(cè)限質(zhì)量濃度分別是2.8 ng/mL、5.3 ng/mL、2.5 ng/mL、3.6 ng/mL。

2.6 儀器精密度精密吸取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，結(jié)果，梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素峰面積的RSD分別為:0.63%、0.76%、0.46%、0.83%?？梢?jiàn)儀器精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性分別精密吸取同一批號(hào)(批號(hào):100618)的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖，結(jié)果，12 h內(nèi)梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的RSD分別為1.11%、1.88%、1.49%、1.53%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定(n=6)。

2.8 方法重復(fù)性取同一批樣品(091107)共6份，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖，結(jié)果樣品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.446 mg/g、7.654 mg/g、1.436 mg/g、1.750 mg/g，RSD分別為0.906%、1.24%，1.12%、1.23%，表明方法重復(fù)性良好(n=6)。

2.9 方法回收率精密稱取已測(cè)定的樣品(批號(hào):100618)共9份，每份約0.1 g，精密稱定，按照供試品中有效成分梔子苷、黃芩苷鹽、鹽酸小檗堿、大黃素量高、中、低(即80%、100%、120%)比例分別精密加入對(duì)照品貯備液適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果分別見(jiàn)表2～5。

2.10 實(shí)際樣品的測(cè)定分別取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表6。3批樣品中，批號(hào)為101156的樣品含量與批號(hào)為091107、100618有明顯的差異。

表2 梔子苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.2 Recovery results of geniposide(n=9)

表3 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.3 Recovery results of baicalin(n=9)

表4 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.4 Recovery resu lts of berberine hyd rochloride(n=9)

表5 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.5 Recovery results of em odin(n=9)

表6 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.6 Contents of four com ponents in Qingfei Yihuo Tablets(n=3)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)［10］，以95%乙醇做提取劑，采用超聲波法比較了20～60 min樣品成分的效果，發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間少于30 min，梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的量明顯少。而30～50 min的梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的量差異不明顯，故本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取時(shí)間為30 min。

3.2 高效液相色譜法與二極管陣列檢測(cè)器聯(lián)用，可在紫外－可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)被分離組分掃描獲得其吸收光譜。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素溶液在200～400 nm進(jìn)行光譜掃描顯示，梔子苷在240、254 nm，黃芩苷在278、320 nm，鹽酸小檗堿在230、265、347 nm，大黃素在230、290 nm處有最大吸收，比較發(fā)現(xiàn)梔子苷在278 nm吸收很小，在240 nm處基線分離無(wú)干擾，響應(yīng)值高、峰形對(duì)稱且尖銳，黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素在278 nm處吸收響應(yīng)值均較高，陰性試驗(yàn)無(wú)干擾，故為有效保證各組分的檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)在240 nm波長(zhǎng)測(cè)定梔子苷，278 nm波長(zhǎng)測(cè)定黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素4種成分。

3.3 根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］，經(jīng)試驗(yàn)最終以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行分析測(cè)定，樣品中待測(cè)峰的峰形對(duì)稱且尖銳，各峰基線能徹底分離，梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素保留時(shí)間適中。

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