王志琪，曾嶸，譚志榮，陳堯，田育望，王蓓，李鑫，陳立峰

(1.湖南中醫(yī)藥大學干細胞中藥調(diào)控與應用實驗室湖南長沙410208;2.湖南中醫(yī)藥研究院中藥新藥研究與開發(fā)省重點實驗室湖南長沙410013;3.中南大學臨床藥理研究所湖南長沙410078)

附子是毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的干燥子根加工品［1］。附子味大辛，性大熱，有大毒。中醫(yī)常將配伍做為附子臨床應用的主要減毒方法之一，正如《景岳全書》所云:“附子之性毒，得甘草而后解”。經(jīng)《中藥方劑數(shù)據(jù)庫》［2］查詢，含川烏、草烏或附子的方劑共10 480條，其中含甘草的共10 090條。目前附子配伍甘草減毒作用的研究主要從配伍前后毒性作用改變和煎液中毒性成分溶出量變化等方面進行，而從藥動學角度考慮附子配伍甘草前后指標成分的體內(nèi)行為比較研究報道較少［3］。

烏頭堿是附子的主要有毒成分，治療劑量和中毒劑量接近，容易引起中毒，但由于烏頭堿煎煮過程中易于水解且代謝迅速，往往難以檢測。實驗研究［4-6］提示在進行甘草及有效成分的藥動學研究時，大鼠是適宜的實驗動物，甘草次酸是適宜的指標成分。本研究采用LC-MS/MS法測定大鼠血漿中烏頭堿量，以LC-MS法測定大鼠血漿中甘草次酸量，并利用DAS2.1軟件計算藥動學參數(shù)，通過考察附子配伍甘草前后烏頭堿和甘草次酸的體內(nèi)藥動學行為來探討附子與甘草配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑附子(批號:20110716)，甘草(批號:2011021805)均購自湖南三湘中藥飲片有限公司(經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學炮制教研室楊梓懿教授鑒定)。烏頭堿(純度:98.5%，批號:MUST-11031101)購自成都曼思特生物科技有限公司;甘草次酸(純度:100%，批號:110723-200612)，維拉帕米(純度:99.7%，批號:100223-200102)和熊果酸(純度:100%，批號:110742-200516)均購自中國食品藥品檢定研究院;空白血漿購自長沙血液中心;色譜純甲基叔丁基醚、乙腈、甲酸銨等購自CNW technologies GmbH公司;試驗用水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器液相色譜系統(tǒng):Waters AcQurity型超高效液相色譜儀帶自動進樣器和柱溫箱，美國Waters公司;MS/MS系統(tǒng):API4000型三重四級桿質(zhì)譜儀，帶電噴霧離子化源(ESI)，美國生物應用公司;數(shù)據(jù)采集:Analyst軟件，美國生物應用公司。分析天平:AB-265S型精密天平(日本梅特勒公司);混合器:漩渦混合器(上海滬西分析儀器廠);打印機:HP LaserJet 1020(HP公司，美國);數(shù)據(jù)處理:Analyst定量處理軟件(美國生物應用公司)，Microsoft Office XP(Excel)軟件(美國微軟公司)，DAS2.1藥代動力學軟件。

1.3 動物與分組SD雄性大鼠156只，SPF級，體質(zhì)量237～292 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務部提供，實驗動物為大鼠，生產(chǎn)許可證號為SCXK(湘)2009-0012，實驗動物合格證號為HNACSDC20101436。實驗動物分為3個藥物組，即附子單煎液組、甘草單煎液組和附子甘草合煎液組，每組各52只。

2 方法

2.1 藥液的制備參考文獻［7-8］的試驗結(jié)果，稱取生附子80 g，加水30倍(2 400 mL)，浸漬30 min，回流提取，加熱至沸騰，保持沸騰1 h，紗布過濾，濾液70℃減壓濃縮，冷卻后定容至1 000 mL，得附子單煎液;稱取甘草80 g，按上述方法制備，得甘草單煎液;稱取生附子和甘草各80 g，同法制備，得附子甘草合煎液。3種藥液分別置于玻璃容器中，－4℃冰箱冷藏保存，待用。上述各藥液中的烏頭堿的定量采用LC-MS/MS法測定，甘草次酸的定量采用LC-MS法測定，以此計算給藥量。

2.2 給藥方案與血樣的采集實驗動物給藥前禁食12 h，自由飲水。3個藥物組分別灌胃給予附子單煎液、甘草單煎液和附子甘草合煎液，給藥體積為2.5 mL/100 g。每藥物組動物按體質(zhì)量分層隨機分為13個采血點:給藥前和給藥后5、15、30、60、120、180、300、480、600、720、1 440、1 680 min，每個采血點4只動物。給藥后動物按時間點斷頭取血，每次采血2.0 mL，置于肝素化的玻璃管中，4 000 r/min，離心10 min，取上清血漿，－20℃冰箱冷凍保存，待測。

2.3 血藥濃度測定血漿樣品中烏頭堿的測定采用前期實驗已建立的LC-MS/MS法［9］。選擇維拉帕米為內(nèi)標，采用MTBE液-液萃取法處理血漿樣品。樣品采用HyPURITY Cyano(150 mm×2.1 mm，5 μm)柱分離，流動相為乙腈-10 mmol/L甲酸銨(70∶30，V/V)，體積流量為0.3 mL/min。然后采用ESI源+MRM掃描分析。烏頭堿和維拉帕米在ESI+源電離方式下主要生成［M+H］+峰，分別為m/z646.4和m/z455.2，選擇此離子作為母離子，對母離子進行碰撞碎裂，碎裂后的子離子分別為m/z586.4和m/z164.9，以這兩個子離子作為定量分析時監(jiān)測的離子。經(jīng)方法學考察，沒有內(nèi)源性物質(zhì)干擾烏頭堿和內(nèi)標的測定，烏頭堿在9.3～2 390 pg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測質(zhì)量濃度為9.3 pg/mL，低、中、高3個濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間變異均＜15%，提取回收率均＞85%，相對回收率在97.94%～101.14%，符合生物樣品藥物濃度測定方法學要求。所采集血樣烏頭堿濃度根據(jù)隨行標準曲線計算，并隨行測定低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品，超出標準曲線范圍上限的樣品用空白血漿稀釋后測定。

血漿樣品中甘草次酸的測定參考文獻［10-11］建立的LC-MS法。選擇熊果酸為內(nèi)標，采用乙酸乙酯液-液萃取法處理血漿樣品。樣品采用HyPURITY Cyano(150 mm×2.1 mm，5 μm)柱分離，流動相為乙腈-10 mmol/L甲酸銨(85∶15，V/V)，體積流量為0.3 mL/min。然后采用ESI源-MRM掃描分析。甘草次酸和熊果酸在ESI－源電離方式下碎裂后的子離子分別為m/z469.4和m/z455.4，以這兩個子離子作為定量分析時監(jiān)測的離子。經(jīng)方法學考察，沒有內(nèi)源性物質(zhì)干擾甘草次酸和內(nèi)標的測定，甘草次酸在1.99～1019.2 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測質(zhì)量濃度為1.99 ng/mL，低、中、高3個濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間變異均＜15%，提取回收率均＞85%，相對回收率在100.04%～111.29%，符合生物樣品藥物濃度測定方法學要求。所采集血樣甘草次酸濃度根據(jù)隨行標準曲線計算，并隨行測定低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，超出標準曲線范圍上限的樣品用空白血漿稀釋后測定。

2.4 數(shù)據(jù)處理將實驗所得血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用DAS2.1藥代動力學軟件進行智能擬合處理，以擬合血藥濃度值與實驗測定值的AIC最小作為判斷標準，獲得相關(guān)藥動學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 血漿中烏頭堿和甘草次酸的測定按照2.5 mL/100 g大鼠體質(zhì)量規(guī)格單次灌胃給藥，用隨行標準曲線法測得附子單煎液和附子甘草合煎液中烏頭堿的給藥量分別為0.14 mg/kg和0.13 mg/kg;甘草單煎液和附子甘草合煎液中甘草次酸的給藥量分別為15.46 mg/kg和15.45 mg/kg。定量測定結(jié)果提示，按水煎法制備藥液時，單煎與合煎對烏頭堿和甘草次酸的定量影響不大。

大鼠單次灌胃給予單煎液和合煎液后烏頭堿的平均血藥濃度-時間曲線見圖1。

圖1 大鼠單次ig后烏頭堿的血藥濃度-時間曲線圖(±s，n=4)Fig.1 Concentration-time curve of aconitine in rat after oral adm inistration by single-dose(±s，n=4)

結(jié)果可知附子單煎液灌胃給藥后，烏頭堿吸收較快，給藥后5 min即可檢測到一定濃度的烏頭堿;灌胃附子甘草合煎液后，烏頭堿達峰時間后延。大鼠單次灌胃給予單煎液和合煎液后甘草次酸的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。甘草單煎液灌胃給藥后，藥物吸收較慢，給藥后2 h可檢測到一定濃度的甘草次酸;灌胃附子甘草合煎液后，甘草次酸達峰時間后延。

圖2 大鼠單次灌胃后甘草次酸的血藥濃度-時間曲線圖(±s，n=4)Fig.2 Concentration-time curve of glycyrrhetic acid in rat after oral adm inistration by single-dose(±s，n=4)

3.2 藥動學參數(shù)血藥濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)DAS軟件擬合表明，烏頭堿和甘草次酸的藥動學為非房室模型，故提供統(tǒng)計矩參數(shù)。大鼠單次分別灌胃給予藥材單煎液和合煎液后烏頭堿和甘草次酸的主要藥動學參數(shù)見表1和表2。附子單煎液給藥后烏頭堿Cmax和AUC均較高，且達峰時間Tmax短而t1/2較長，表明附子單煎液中的烏頭堿口服吸收快消除較緩慢。附子甘草合煎液中烏頭堿Cmax和AUC均明顯降低，Tmax明顯延長，t1/2縮短，表明附子與甘草配伍后烏頭堿的吸收收到明顯抑制，吸收速度變慢，吸收的量減少，且消除加快。

表1 大鼠單次灌胃后烏頭堿的主要藥動學參數(shù)(±s，n=52)Tab.1 M ain pharmacokinetic parameters for aconitine of rat after single ingastric adm inistration(±s，n=52)

表1 大鼠單次灌胃后烏頭堿的主要藥動學參數(shù)(±s，n=52)Tab.1 M ain pharmacokinetic parameters for aconitine of rat after single ingastric adm inistration(±s，n=52)

h/L 730.66±152.63 538.97±114.13 AUC(0－∞)pg·h/L 1067.50±293.20 630.02±94.89 MRT(0－t)h 8.78±0.06 9.33±0.29 MRT(0－∞)h 20.04±4.36 13.54±3.68 t1/2 h 14.69±3.30 7.81±3.88 Cmax pg/L 91.43±23.37 42.47±10.56 AUC(0－t)pg·Tmax h 1.0±0 7.25±1.0

表2 大鼠單次灌胃后甘草次酸的主要藥動學參數(shù)(±s，n=52)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for glycyrrhetic acid of rat after single ingastric adm inistration(±s，n=52)

表2 大鼠單次灌胃后甘草次酸的主要藥動學參數(shù)(±s，n=52)Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for glycyrrhetic acid of rat after single ingastric adm inistration(±s，n=52)

h/L 8159.83±1597.66 7035.89±1333.28 AUC(0－∞)ng·h/L 11193.89±2504.36 8315.67±1497.17 MRT(0－t)h 14.30±0.27 14.46±0.29 MRT(0－∞)h 22.61±4.21 18.72±1.41 t1/2 h 11.99±2.91 9.57±1.57 Cmax ng/L 526.5±68.22 458.25±63.59參數(shù)單位甘草單煎液組附子甘草合煎液組AUC(0－t)ng·Tmax h 8.0±0 12.0±0

4 討論

附子中主要含烏頭類生物堿，甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸等酸性皂苷類成分，附子和甘草是一對酸堿藥對。附子和甘草配伍使用時甘草可降低附子的毒性作用，這一觀點已被多數(shù)人認識，但具體的解毒環(huán)節(jié)和機理不甚清楚。藥動學參數(shù)可直觀反映藥物的體內(nèi)過程特點，故近年來藥物特別是天然藥物之間的相互作用與藥動學特性改變之間的關(guān)系成為近年來研究藥物相互作用的熱點領(lǐng)域［12］，尤其是對于治療窗窄、需要進行用藥監(jiān)測的藥物而言此類研究顯得尤為重要。

實驗中測定了藥材單煎液和合煎液中烏頭堿和甘草次酸的含量，結(jié)果顯示甘草與附子配伍對毒性成分烏頭堿和甘草主要生物活性成分甘草次酸的溶出并無明顯，這一結(jié)果與文獻［13］一致。實驗中對大鼠單次分別灌胃給予藥材單煎液和合煎液后烏頭堿和甘草次酸的血藥濃度進行了測定。結(jié)果顯示單煎液中烏頭堿在大鼠體內(nèi)吸收迅速，消除需要相對較長時間，這與烏頭類生物堿易引起急性中毒的特點吻合;單煎液和合煎液中甘草次酸的在大鼠體內(nèi)吸收均較為緩慢，且24 h后仍可檢測到較高濃度，這與文獻［10］的情況相似;兩藥配伍使用后烏頭堿和甘草次酸在大鼠體內(nèi)的藥動學行為均發(fā)生了改變:Tmax均推遲，Cmax均降低，吸收均受到抑制，t1/2均縮短。本實驗數(shù)據(jù)提示:甘草與附子配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與其體外化學成分含量的變化無關(guān)，而是由于烏頭堿與甘草次酸在體內(nèi)發(fā)生了結(jié)合反應，延緩了其在胃腸道的吸收，加速其消除，從而發(fā)揮解毒作用。

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