郭 強(qiáng) 韋 強(qiáng) 邊心超 張金柱 王宏磊 (吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

自噬作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，在腫瘤、老化和神經(jīng)退化等細(xì)胞增殖和死亡紊亂疾病中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注到在缺血性腦卒中不僅有細(xì)胞的凋亡和壞死的參與，尚有細(xì)胞自噬參與其中。本文就細(xì)胞自噬和缺血性腦卒中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 自噬的概念

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程，是生命進(jìn)化過(guò)程中一種保守的細(xì)胞行為，也是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。自噬參與了細(xì)胞對(duì)持續(xù)性?xún)?nèi)外刺激的非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝和功能的平衡方面起重要的作用〔1〕。在細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分裂中，必然會(huì)出現(xiàn)一些不需要的生物大分子和受損、衰老的細(xì)胞器，而自噬就參與這些物質(zhì)的降解和再利用。通常這些待降解物首先被細(xì)胞內(nèi)單層或雙層膜包裹形成自噬體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體，最后在溶酶體內(nèi)被多種水解酶水解。

首先，水解生成的氨基酸和脂肪酸可以被用來(lái)合成新的蛋白質(zhì)或參與能量代謝。而該作用在細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種不利應(yīng)激的情況下(如營(yíng)養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)因子撤離、輻射等)，尤為重要。通過(guò)這種方式細(xì)胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而限制其損傷和死亡〔2〕。

其次，通過(guò)自噬及時(shí)清除多余或損傷的細(xì)胞器，對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞的正常功能和避免細(xì)胞衰老等至關(guān)重要。再次，消滅致病微生物，并參與抗原遞呈過(guò)程〔3〕。但是，自噬的過(guò)度發(fā)生可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，從而引起一系列疾病過(guò)程〔4〕。這種自噬性程序性細(xì)胞死亡同凋亡(I型程序性死亡)明顯相異，被學(xué)者稱(chēng)為Ⅱ型程序性死亡〔5〕。

2 細(xì)胞自噬的過(guò)程

自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過(guò)程。在此過(guò)程中自噬體的形成是關(guān)鍵。其發(fā)生過(guò)程大致分為3個(gè)階段:

2.1 自噬誘導(dǎo) 在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來(lái)源的自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周?chē)?，7〕。自噬前體的誘導(dǎo)過(guò)程可以是選擇性的，也可以是非選擇性的，分別稱(chēng)為選擇性自噬和非選擇性自噬，前者是指游離膜結(jié)構(gòu)識(shí)別并包裹胞質(zhì)內(nèi)的特殊底物形成自噬體，并將其降解，如Cvt途徑(cytoplasm to vacuole targeting pathway)和過(guò)氧化酶體降解(pexophagy)途徑;后者是指隨機(jī)包裹細(xì)胞質(zhì)形成自噬體。釀酒酵母是選擇性自噬的典型的例子，釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中的Apel蛋白(aminopeptidase 1)通過(guò)Cvt途徑直接運(yùn)輸至雙層膜泡結(jié)構(gòu)〔8〕。選擇性自噬主要由細(xì)胞內(nèi)的底物誘導(dǎo)發(fā)生，而非選擇性自噬主要是對(duì)細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果。在饑餓或生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)可誘導(dǎo)非選擇性自噬的發(fā)生。缺氧的信號(hào)使mTOR信號(hào)途徑失活，從而激活自噬信號(hào)途徑。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的作用下，Atg相關(guān)蛋白被修飾而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

2.2 自噬體形成 分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成自噬體。自噬前體誘導(dǎo)形成后，游離膜結(jié)構(gòu)繼續(xù)與自噬前體結(jié)合，逐漸構(gòu)成自噬體。在Cvt途徑，游離膜以底物作為支架添加到自噬前體上，使自噬前體逐漸形成自噬體。

非選擇性自噬是依靠Atgl2-At95-Atgl6復(fù)合物為支架完成自噬體形成。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Atg12、At95和Atgl6被募集到自噬前體的雙層膜結(jié)構(gòu)上，并形成較大的寡聚復(fù)合體。此決定雙層膜的曲度，并募集含有At98的游離膜結(jié)構(gòu)，使自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)不斷延長(zhǎng)，形成自噬體〔9〕。

2.3 自噬體內(nèi)容物的降解 自噬體通過(guò)細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體，與之融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，自噬體膜脫落再循環(huán)利用〔10〕。Atgl2-At95復(fù)合物與 Atgl6解聚，At98從自噬體上脫離下來(lái)后，自噬體被運(yùn)輸至溶酶體，其外膜與溶酶體膜融合，自噬體內(nèi)膜及其內(nèi)容物進(jìn)入溶酶體腔。在各種酸性酶的催化下，底物降解為氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)。

調(diào)節(jié)上述復(fù)雜的過(guò)程的分子水平有五個(gè)關(guān)鍵階段〔11〕:(1)形成吞噬泡。(2)At95-12復(fù)合物與Atgl6L多聚化。(3)LC3形成并且插入吞噬泡膜。(4)包繞預(yù)被降解物。(5)自噬體與溶酶體融合〔12〕。

3 自噬的調(diào)控機(jī)制

3.1 依賴(lài)mTOR(marnmalian target of rapamycin)途徑的自噬

雷帕霉素靶蛋白mTOR，是一種氨基酸、ATP、生長(zhǎng)因子、胰島素等分子的感受器，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制自噬方面起關(guān)鍵性作用。酵母中Ser/Thr蛋白激酶Atgl于其他Atg分子結(jié)合定位于自噬體前膜上。饑餓刺激下，Atgl3去磷酸化，并與Atgl結(jié)合，導(dǎo)致Atgl7依賴(lài)性自噬的發(fā)生〔13〕。mTOR活性抑制時(shí)，促進(jìn)自噬體形成，在酵母中是通過(guò)Atsl和Atgl3去磷酸化而促進(jìn)下游自噬信號(hào)，但在人類(lèi)中的是否為該機(jī)制尚不明了。mTOR活性增強(qiáng)時(shí)，通過(guò)磷酸化S6KI激活之，進(jìn)而磷酸化核糖體蛋白S6

(p70s6)來(lái)促進(jìn)mRNA翻譯，同時(shí)促使核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的黏附而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫落形成自噬體膜。mTOR同時(shí)也磷酸化4EBPs并抑制其活性，解除了對(duì)真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子elF4E的抑制〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)在氨基酸豐富時(shí)，mTOR信號(hào)激活，自噬被抑制，S6K1活性增強(qiáng)，增加了mRNA翻譯、蛋白質(zhì)合成。氨基酸缺乏時(shí)，原料減少，蛋白質(zhì)合成減少，同時(shí)mTOR信號(hào)被抑制，自噬增強(qiáng)，S6KI活性減弱，負(fù)反饋IRS/Class I PDK的作用減弱，也增強(qiáng)了自噬〔15，16〕。

3.2 依賴(lài)磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)途徑的自噬Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class III PI3K)復(fù)合物(Atg6-Atgl4-Vpsl5-ClassⅢPI3K)在細(xì)胞自噬中扮演重要的角色。它可以將磷脂酰肌醇(PI)磷酸化為3-磷脂酰肌醇(PI3P)，進(jìn)而募集胞漿中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成〔17〕。另外抑癌基因Atg6的哺乳動(dòng)物同源體beclinl和抑癌基因UVRAG作為自噬正調(diào)控子，抗凋亡因子bcl-2作為自噬負(fù)調(diào)控子共同參與組成Class III PI3K復(fù)合物調(diào)控自噬〔18，19〕。經(jīng)典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)并非作用于mTOR途徑，而是通過(guò)抑制ClassmPI3K的活性從而抑制自噬形成。

3.3 Ras/PKA通路 有研究證實(shí):哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞細(xì)胞中Ras/PKA通路可感受細(xì)胞外葡萄糖含量的變化，并影響到自噬基因的表達(dá)。在酵母細(xì)胞中，Ras/PKA通路通過(guò)抑制TOR而抑制自噬，表明Ras/PKA通路抑制自噬作用與TOR-Tap42通路平行。Atgl作為PKA的磷酸化底物可能參與到Ras/PKA通路的調(diào)節(jié)當(dāng)中，使Ras/PKA抑制自噬得以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)酵母細(xì)胞中的sch9與哺乳作用與動(dòng)物細(xì)胞中的PKB/Akt相似，也參與感受細(xì)胞外葡萄糖水平。

3.4 AMPK途徑 自噬活性對(duì)細(xì)胞存活十分重要。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，AMPK感受ATP的水平。通過(guò)上游激酶LKBl下調(diào)ATP/AMP比例而激活A(yù)MPK。活性的AMPK誘導(dǎo)TSCl/2復(fù)合體磷酸化并有活性，TSCl/2復(fù)合體可通過(guò)Rheb抑制mTOR活性。除此之外，LKBl-AMPK使P27磷酸化并有活性，后者可在生長(zhǎng)因子缺乏或營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)阻滯細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)自噬。與AMPK相同，酵母細(xì)胞中的Snfl也可正向誘導(dǎo)自噬。

4 自噬和缺血性腦卒中

自噬(autophagy)是細(xì)胞適應(yīng)惡劣環(huán)境的一種生存機(jī)制，通過(guò)這種方式細(xì)胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而限制其損傷和死亡。從這一觀點(diǎn)出發(fā)，認(rèn)為自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用〔20〕。Puyal和 Clarke〔21〕在大鼠腦缺血模型研究中觀察到，缺血灶周?chē)X組織神經(jīng)元中的溶酶體和自噬活動(dòng)均顯著增強(qiáng)，認(rèn)為自噬活動(dòng)對(duì)缺血周?chē)X組織具有保護(hù)作用。有研究表明腦缺血缺氧后，自噬基因ATG7缺失的新生鼠較正常新生鼠能夠有效的減輕腦損傷，不但能夠減少自噬性死亡，而且減少了凋亡;ATG7缺失的成年鼠腦缺血缺氧后，自噬性死亡是海馬錐體細(xì)胞死亡的重要方式〔22〕。Carloni等〔23〕在新生小鼠缺血缺氧性腦損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)上調(diào)，并在24 h達(dá)高峰;同樣，IPC后Beclin-l表達(dá)也顯著上調(diào)。在缺血前20 min經(jīng)側(cè)腦室注入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3.methyladenine，3-MA)可顯著下調(diào)Beclin-l表達(dá)，同時(shí)海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡顯著增多;相反，經(jīng)側(cè)腦室注入自噬激活劑雷帕霉素(rapomycin)可顯著上調(diào)Beclin-1表達(dá)，同時(shí)海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡顯著減少。最近，Carloni等〔24〕進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活劑雷帕霉素能抑制核糖體s6蛋白激酶(ribosomes 6 protein kinase，pTOS6K)磷酸化以及顯著上調(diào)Beclin-l和LC3表達(dá)，而自噬抑制劑渥曼青霉素(wort，mnnin)可顯著減少Akt和cAMP的應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(eAIVIPresponse element-binding protein，CREB)磷酸化，但不會(huì)影響p70S6K磷酸化以及Beclin-I和I.L-3表達(dá)。Tizon等〔25〕證實(shí)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，CysC)可以通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而保護(hù)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。因此認(rèn)為通過(guò)調(diào)節(jié)CysC表達(dá)有望為缺血性卒中的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

但現(xiàn)有的研究結(jié)果卻并不完全一致。因過(guò)度激活的自噬會(huì)引起Ⅱ型細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，故有學(xué)者又認(rèn)為自噬的激活也是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要原因〔26，27〕。成年大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型研究表明，缺血半暗帶區(qū)域的自噬顯著激活，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA或巴弗洛霉素A1(bafliomycin A1)阻斷自噬，可使梗死體積顯著縮小，腦水腫和大鼠行為學(xué)損害均得到顯著改善〔28，29〕。Koike 等〔30〕采 用 自 噬 基 因 缺 陷 大 鼠、胱 冬 酶(caspase)-3基因缺陷大鼠以及胱冬酶活化DNA酶抑制大鼠模型來(lái)分析腦缺血缺氧性損傷后的神經(jīng)元死亡情況，結(jié)果證實(shí)，自噬基因Atg7表達(dá)陰性的大鼠海馬錐體細(xì)胞自噬受到明顯抑制，同時(shí)海馬區(qū)神經(jīng)元死亡較對(duì)照組明顯減少。由此推測(cè)，自噬的產(chǎn)生可能會(huì)加重神經(jīng)元損害，促進(jìn)其死亡，從而對(duì)自噬在腦缺血后的保護(hù)作用提出了質(zhì)疑。因此，自噬在腦缺血缺氧性損害中的確切作用仍然存在爭(zhēng)議，自噬是加重還是減輕缺血后神經(jīng)元損害尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

5 展望

隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)細(xì)胞自噬在心腦血管缺血缺氧、缺血再灌注及細(xì)胞凋亡等方面的研究，自噬同腦卒中的密切關(guān)系正被人們發(fā)現(xiàn)并重視。對(duì)腦卒后缺血半暗帶的保護(hù)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而自噬在腦缺血半暗帶病理生理變化中扮演著重要的角色。相信隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)一步深化，我們能夠找到自噬通路中某些關(guān)鍵的靶點(diǎn)。通過(guò)這些關(guān)鍵點(diǎn)我們可能成功逆轉(zhuǎn)某些卒中病人的神經(jīng)功能損害，為人類(lèi)的健康作出里程碑式的貢獻(xiàn)。

1 Meijer AJ，Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004;36(12):2445-62.

2 楊光明，高 鵬.自噬-程序性細(xì)胞死亡的執(zhí)行者與管理者〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2010;16(14):2106.

3 Mizushima N.Autophagy:process and function〔J〕.Genes，2007;21(22):2861-73.

4 Klionsky DJ.Autophagy:from phenomenology to molecular understanding in less than a decade〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2007;8(11):931-7.

5 Huang J，Klionsky DJ.Autophagy and human disease〔J〕.Cell Cycle，2007;6(15):1837-49.

6 Axe EL，Walker SA，Manifava M，et al.Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum〔J〕.J Cell Biol 2008;(8):685-701.

7 Simonsen A，Tooze SA.Coordination of membrane events during autophagy by multiple class Ⅲ P13-kinase complexes〔J〕.J Cell Biol，2009;86:773-82.

8 Shintani T，Huang WP，Stromhaug PE，et al.Mechanism of cargo selection in the cytoplasm to vacuole targeting pathway〔J〕.Dev Cell，2002;3:825-37.

9 Klionsky DJ.Molecular machinery of autophagy:unanswered questions〔J〕.J Cell Sci，2005;118:7-18.

10 杜海磊，邱偉華.細(xì)胞自噬與腫瘤〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2010;26(2):401-4.

11 Glick D，Barth S，Macleod KF.Autophagy:cellular and molecular mechanisms〔J〕.J Pathol，2010;1221:3-12.

12 劉杉珊，李 薇.噬現(xiàn)象及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.中外健康文摘，2011;8(8):448.

13 kamada Y，Sekito T，Ohsumi Y.Autophagy in yeast:a TOR-mediated response to nutrient starvation〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol，2004;279(1):73-84.

14 葉 青.自噬的分子機(jī)制與病理生理意義〔J〕.國(guó)際病理科學(xué)與帷床雜志，2007;8(27):358-62.

15 Goertin DA，Sabatinl DM.An expanding role for mTOR in cancer〔J〕.Trends Med，2005;11(8):353-61.

16 Meijer AJ，Codogno P.Signaling and autophagy regulation in health，aging and disease〔J〕.Mol Aspects Med，2006;27(5-6):29-31.

17 Levine B，Yuan J.Autophagy in cell death:an innocent convict〔J〕.J Clin Invest，2005;115(10):2679-88.

18 Ng G，Hung J.The Significance of autophagy in cancer〔J〕.Mot Careinog，2005;43(4):183-7.

19 Paludan C，Sehmid D，Landthuler M，et al.Endogenous MHC cDzsⅡ:processing of a viral nuclear antigen after autophagy〔J〕.Science，2005;307(5709):593-6.

20 Yue Z，Jin S，Yang C，et al.Beclin 1，an autophagy gene essential for early embryonic development，is a haploinsufficient tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA ，2003;100:15077-82.

21 Puyul J，Clwke PG.Targeting autophagy to prevent neonatal stroke damage〔J〕.Autophagy，2009;5:1060-1.

22 Koike M，Shibata M，Tadakoshi M，et al.Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury〔J〕.Am J Pathol，2008;172(2):454-69.

23 Carloni S，Buonocore G，Balduini W.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia irduced brain injury〔J〕.Neurobiol Dis，2008;32:329-39.

24 Carloni S，Girelli S，Scopa C，et al.Activation of autophagy and Akt/CREB signaling play anequivalent role in the neuroprotective effect of rapamycin in monatal hypoxia-ischemia〔J〕.Autophagy，2010;6:366-77.

25 Tinzon B，Sahoo S，Yu H，et al.Induction of autophagy by cystatin C:a mechanism that protects murine primary conical neurons add netronal cell lines〔J〕.PLOS One，2010;5:e9819.

26 Boland B，Nixon RA.Neuronal macroautophagy:from development to degeneration〔J〕.Mol Aspects Med，2006;27(5-6):503-19.

27 Yu L，Alva A，Su H，et al.Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8〔J〕.Science，2004;304:1500-2.

28 Wen YD，Sheng R，Zhang LS，et al.Neoronal injury in rat model of:HmanerR focal cerebral ischemia is associated with activation of autophagic and lysosomal patnways〔J〕.Autophagy，2008;4:762-9.

29 Puya J，Vaslin A，Mottier V，et al.Postischemic treatment of neonatal cerebral ischemia should target autophagy〔J〕.Ann Neurol，2009;66:378-89.

30 Koike M，Shibata M，Tadakoshi M，et al.Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal nelffon death after hypoxic-ischemic injury〔J〕.Ann J Pathol，2008;172:454-69.