王 凡， 任家謀， 齊曉嵐， 楊 華， 官志忠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種最常見的人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，臨床上將其定義為進(jìn)行性認(rèn)知功能的喪失和從中年期到晚年期緩慢發(fā)生的進(jìn)行性記憶損傷，其主要臨床特征為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力進(jìn)行性衰退、失語等［1］。病理學(xué)上以細(xì)胞外老年斑形成及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主要特征［2］。腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(βamyloid protein，Aβ)的產(chǎn)生、聚集和沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制的首要和中心環(huán)節(jié)。體內(nèi)的 Aβ的是由β淀粉樣蛋白前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)經(jīng) β-和 γ-分泌酶水解生成。而 α-分泌酶將APP位于細(xì)胞表面的Aβ功能區(qū)切割掉而排出，剩下的約100～140KD的可溶性APP(soluble APP，αAPPs)，有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)功能［3］。α-分泌酶是一種解聚素和金屬蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease，ADAM)，現(xiàn)已證明 ADAM 10 具有 α-分泌酶活性［4］。目前認(rèn)為神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿受體(neuronal nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中可見 α7 nAChR的選擇性升高，提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過具有一定結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，促使同源性mRNA分子特異性降解同時(shí)可抑制其翻譯，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的過程［5］。本研究用體外合成的siRNA抑制SH-SY5Y細(xì)胞α7 nAChR的表達(dá)，研究其受抑制后 APP代謝的關(guān)鍵酶α-分泌酶表達(dá)水平的變化，從而探討 α7 nAChR在 AD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1．1 材料 源于人腦的SH-SY5Y細(xì)胞由本課題組保存;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0．25%胰酶購于HyClone公司;鼠抗人α7 nAChR單克隆抗體(sc-65865)，鼠抗人α分泌酶ADAM10單克隆抗體(sc-28358)及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的驢抗鼠二抗(sc-2314)、α7 nAChR siRNA(sc-42532)、siRNA 陰性對照(sc-37007)、siRNA熒光質(zhì)控(sc-36869)、siRNA轉(zhuǎn)染試劑(sc-29528)、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(sc-36868)均購于 Santa Cruz公司;Oligo dT、dNTP購于上海生工公司;Trizol試劑購于 Invitrogen公司;MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega公司;RNA酶抑制劑購于Toyobo公司;Syber-green 2×PCR Mix購于Roche公司;鼠抗人 β-actin單克隆抗體(A-1987)購于 Sigma公司;聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus發(fā)光試劑、高效顯影膠片購于 Amersham公司;顯影液、定影液購于柯達(dá)公司;細(xì)胞裂解液購于碧云天公司，普通化學(xué)試劑均購于Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為DMEM，添加15%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)培養(yǎng)箱中含5%CO2，溫度為37℃。細(xì)胞分組為空白對照組、陰性對照組、轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA即RNA干擾組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1．2．2 siRNA的轉(zhuǎn)染 生長良好的細(xì)胞用0．25%胰蛋白酶消化傳入六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其匯合度達(dá)80%時(shí)按Santa Cruz公司轉(zhuǎn)染說明書以不同比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染siRNA熒光質(zhì)控，根據(jù)熒光值摸索和優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染條件。再分別轉(zhuǎn)染α7 nAChR siRNA、siRNA陰性對照，轉(zhuǎn)染后6h換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，并設(shè)未轉(zhuǎn)染組作為空白對照，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1．2．3 Real-time PCR檢測mRNA水平 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行Real-time PCR，采用 Syber green 法測定。α7 nAChR、α-分泌酶ADAM10和內(nèi)對照 β-actin引物序列見表1，ABI Step One plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內(nèi)對照β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號，以 Applied Biosystems SDS1．4軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1．4軟件分析其△△Ct值及RQ(relative quantity)值，RQ=2－△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以 β-actin 為內(nèi)對照，計(jì)算各基因在實(shí)驗(yàn)組與對照組的相對水平。

表1 熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物片段

圖1 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA后 α7 nAChR mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平

圖2 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA后ADAM10 mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平

1．2．4 蛋白表達(dá)水平的測定 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白并定量，用 Western blotting方法檢測α7 nAChR、ADAM10蛋白表達(dá)水平。以 β-actin作為內(nèi)對照。以Labworks軟件分析結(jié)果時(shí)以β-actin蛋白條帶作為內(nèi)對照，計(jì)算 α7 nAChR、ADAM10蛋白條帶與β-actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為蛋白表達(dá)的相對水平。

2 結(jié)果

2．1 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA 后 α7 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細(xì)胞 α7 nAChR mRNA(見圖1A)水平和蛋白(見圖1B)表達(dá)明顯降低，與對照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，轉(zhuǎn)染陰性對照與對照組相比無差異。說明已將 α7 nAChR siRNA轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞，且抑制了 α7 nAChR mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

2．2 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA 后 ADAM10 mRNA及蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染 α7 nAChR siRNA后SH-SY5Y細(xì)胞ADAM10 mRNA及蛋白表達(dá)水平分別降低了73%(見圖2A)和66%(見圖2B)，與對照組相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，轉(zhuǎn)染陰性對照與對照組相比無差異。下調(diào)α7 nAChR水平能使α-分泌酶 ADAM10的表達(dá)水平降低。

3 討論

RNAi能特異性抑制基因表達(dá)，是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptional gene silencing，PTGS)［5］。RNAi即通過 siRNA 高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使靶mRNA特異性降解并能抑制其翻譯，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的過程。目前 RNAi技術(shù)已廣泛用于功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)、新的藥物開發(fā)等眾多領(lǐng)域［6］。

nAChR是一類明確的具有神經(jīng)保護(hù)功能的受體，其減少與AD的發(fā)生有關(guān)，但其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。大量研究報(bào)道:AD患者腦中膽堿能系統(tǒng)嚴(yán)重受損，腦組織中多個(gè)區(qū)域中 nAChR水平降低，AD患者大腦 nAChR密度降低［7］。有報(bào)道指出在AD中最脆弱的神經(jīng)元是那些高表達(dá)nAChR的神經(jīng)元，特別是含有α7亞單位的［8］，且在 AD患者觀察到的膽堿能損傷與α7 nAChR水平下降和突觸連接損傷有關(guān)，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性方面具有獨(dú)特的作用［9］。在 APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中可見α7 nAChR的選擇性升高，也提示α7 nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。本研究將針對α7 nAChR的siRNA片段轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞中，mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降了。表明 α7 nAChR siRNA能有效地抑制內(nèi)源性α7 nAChR的表達(dá)。

AD患者腦組織中老年斑的主要成分為 Aβ，來自于它的前體蛋白 APP。APP有兩條代謝途徑［3］:一條由 β-分泌酶切割A(yù)PP，產(chǎn)生可溶性的 sAPPβ和C99，C99再經(jīng) γ-分泌酶切割，產(chǎn)生完整的全長39～43個(gè)氨基酸的Aβ(4kD)片段，只有完整的Aβ才具有神經(jīng)毒性。病理情況下后一代謝途徑增強(qiáng)，具有神經(jīng)毒性的完整的 Aβ生成增多;另一條則是由 α-分泌酶在 Aβ內(nèi)部切割 APP，產(chǎn)生不完整的 Aβ，具有神經(jīng)營養(yǎng)等作用。當(dāng)前，針對 AD的分子機(jī)制提出了多種治療途徑，其中干預(yù)APP的加工，減少Aβ的生成，選擇性地提高 α-分泌酶、降低 β-分泌酶的活性是一種非常有效的途徑。

我們前期的研究表明，通過 RNAi方法選擇性下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中 α7 nAChR的表達(dá)能使細(xì)胞Aβ生成增多，這可能與受體表達(dá)抑制后 β-分泌酶BACE1的表達(dá)增加有關(guān)，從而促進(jìn)老年斑的形成。此次我們針對 APP代謝中另一種重要的酶 ADAM10進(jìn)行了研究，ADAM10是細(xì)胞膜上一種重要的調(diào)節(jié)分子，體內(nèi)ADAM10在可改善AD的學(xué)習(xí)記憶能力［10］。Kuhn 等［11］利用 RNA 干擾技術(shù)敲除 ADAM10，證明 ADAM10是組成 α-分泌酶的主要成員。研究表明α7 nAChR基因表達(dá)抑制能明顯降低α-分泌酶ADAM10 mRNA及蛋白水平的表達(dá)，從而減少αAPPs的生成，而 BACE的表達(dá)是增加的，表明β APPs產(chǎn)生增加，從而增加 Aβ的產(chǎn)生與蓄積，這可能是 AD發(fā)病中 Aβ生成增多的機(jī)制，提示 α7 nAChR對AD可能具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

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