楊薈敏 祝佳瑋 趙宸龍 張晨光 張 紅 趙文明

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院細胞生物學(xué)系，肝臟保護與再生調(diào)節(jié)北京市重點實驗室，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)院免疫學(xué)系，北京100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100069)

含有巰基/二硫鍵的化合物在體內(nèi)發(fā)揮著多種不同的作用，可參與調(diào)控細胞信號傳導(dǎo)，蛋白質(zhì)以及其他分子化合物等的組成、轉(zhuǎn)運和功能等。體內(nèi)含有巰基/二硫鍵的化合物有半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/ cystine，Cys/CySS)，谷胱甘肽氧化態(tài)/還原態(tài)(reduced glutathione/oxidized glutathione，GSH/GSSG)以及硫氧還原蛋白1和2(thioredoxin1/2，Trx1/2)［1］等，這些物質(zhì)在體內(nèi)環(huán)境中以氧化態(tài)和還原態(tài)的形式存在，處于動態(tài)變化的過程中并最終達到一個相對氧化還原平衡的狀態(tài)。一旦這種平衡狀態(tài)被破壞，機體即啟動與超氧自由基產(chǎn)物的相關(guān)機制，從而影響脂蛋白修飾、轉(zhuǎn)換和細胞功能及代謝素產(chǎn)生損傷［2-4］，而且可對葡萄糖和糖蛋白的自身氧化作用和抗氧化酶的糖化作用產(chǎn)生影響。

氧化應(yīng)激參與體內(nèi)多種生理活動及疾病的發(fā)生［5］，因此，尋找能夠探測體內(nèi)氧化還原狀態(tài)生物學(xué)指標的簡單且準確的方法，對研究氧化應(yīng)激參與的體內(nèi)生理活動極為重要。目前，檢測體內(nèi)某種蛋白氧化還原狀態(tài)的方法很多。應(yīng)用比較廣泛的主要有氧化還原蛋白免疫印記法［5］;生物素標記的碘乙酰胺蛋白免疫印記法［6-7］;此外還有一些相關(guān)的測定方法如：酶循環(huán)法［8］、磁共振光譜檢測法［9］以及電化學(xué)測定法［10］等。但這些方法在某些方面如檢測靈敏度，相對精確定量蛋白的氧化還原狀態(tài)等受到實驗條件的限制，具有一定的局限性。并且在同時檢測體內(nèi)多種物質(zhì)的氧化還原狀態(tài)上也受到一定的限制。另外，目前國內(nèi)文獻［8-10］報道主要集中在用HPLC檢測血漿中還原態(tài)物質(zhì)如GSH、Cys等的含量。因此，尋找能夠同時測定體內(nèi)多種氧化及還原狀態(tài)物質(zhì)的方法對準確反映體內(nèi)氧化應(yīng)激的狀態(tài)極為重要。本方法可同時檢測血漿中含巰基/二硫鍵化合物 Cys/CySS和GSH/GSSG形成的氧化還原對的含量，并根據(jù)能斯特方程計算出相應(yīng)的氧化還原電勢。此方法是用碘乙酸封閉血漿中自由的巰基，通過丹磺酰氯衍生化后，利用HPLC進行分離檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

1)實驗材料：水合紅菲繞啉二磺酸鈉(bathophenanthroline disulfonic acid disodium salt hydrate，BPDS)，丹磺酰氯，L-絲氨酸，Cys，CySS，GSH，GSSG，70%高氯酸(HPLC級)，甲醇(HPLC級)均購于美國Sigma公司。內(nèi)參谷氨酰谷氨酸(γ-glutamylglutamate，γ-GG)購于美國 MP Biomedicals公司，碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)，肝素鈉購于北京信德科興科學(xué)器材有限責(zé)任公司，硼酸、四硼酸鈉、丙酮、氯仿、冰醋酸均為國產(chǎn)分析純級別。SD雄性大鼠(190～210g)購于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，實驗動物許可證號：2006－0009。

2)儀器：高效液相色譜儀為Wasters 2695，以及熒光檢測器Wasters 2475(激發(fā)波長315nm，發(fā)射波長518nm)。

1.2 主要試劑的配制

1)主要溶液的配制：①含有內(nèi)參的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L，pH 8.5)：稱取 12.4 g硼酸，19 g Na2B4O7·10 H2O，溶于500 mL雙蒸水中;加入內(nèi)參γ-GG，終濃度為165 μmol/L。②A液的配制：稱取1.53 g L-絲氨酸，25 mg肝素鈉，50 mg BPDS，300 mg IAA溶于10 mL含有內(nèi)參γ-GG的硼酸鹽緩沖液(0.5 mol/L)中，充分混勻(pH 8.0)。分裝為每管150 μL。于－20℃保存。③B液的配制：0.2 mol/L含有10%高氯酸的硼酸液：稱取6.2 g硼酸至300 mL雙蒸水中，加入71 mL 70%高氯酸混勻后，再用雙蒸水定容至500 mL(pH 1.0)。分裝為200 μL/管，于－20℃保存。

2)標準樣品的制備：精確稱取適量的Cys，CySS，GSH，GSSG溶解于10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，制成濃度均為5 μmol/L的Cys，CySS，GSH，GSSG混合溶液。然后加入IAA和內(nèi)參γ-GG，濃度分別為7.4g/ L和10 μmol/L。分裝，于－20℃保存。

3)血漿樣品的制備：取1 350 μL全血，加入150 μL A液，室溫放置一段時間，使IAA與巰基充分結(jié)合。將管輕輕倒置2次混合溶液，然后16 000g離心1 min。取上清200 μL，加入200 μL B液，再輕輕將管倒置2次，混勻后于－20℃保存。

1.3 實驗方法

1)樣品的衍生化：將標準樣品及血漿樣品取出，待樣品融化后，16 000g離心2min，取300μL上清置于新離心管中，加入1 mol/L KOH/飽和硼酸鹽溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0±0.2，放置大約3min，充分清除高氯酸鉀。加入300μL丹磺酰氯溶液(20mg/mL丹磺酰氯溶于丙酮，現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫避光16～26 h，加入500μL氯仿，8 000 r/min離心 5min。取上清，于－20℃保存。

2)色譜條件：色譜柱為LC-NH2硅膠柱(25cm × 4.6mm，5μm，美國Sigma公司)。流動相I為80%甲醇，20%雙蒸水。流動相Ⅱ為63%甲醇，27%冰醋酸，10%雙蒸水，0.002 5mol/L無水乙酸鈉。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度程序Tab.1 Procedure of solvent gradient (%)

2 結(jié)果

2.1 標準樣品的檢測及其重復(fù)性

為檢測本方法的可行性及重復(fù)性，我們首先對已知濃度的標準樣品中各組進行了檢測。按照1.2中2)的方法準確配制含有5 μmol/L Cys、CySS、GSH、GSSG，和10 μmol/L內(nèi)標γ-GG的混合標準樣品，并將其分為5份，分別測定各樣品中Cys、CySS、GSH、GSSG以及γ-GG的保留時間和峰面積。以第1次結(jié)果和第5次結(jié)果為例作圖(圖1)。各組分的保留時間及峰面積見表2。用于標準定量的內(nèi)標γ-GG在保留時間和峰面積上均顯示了極高的重復(fù)性，RSD值均≤1%，為后期樣品濃度的精確定量提供了基礎(chǔ)。Cys、CySS、GSH、GSSG的保留時間及峰型的RSD值也都≤10.8%，具有較好的重合性。實驗說明此方法可以準確檢測出標準樣品中各物質(zhì)的含量，并且具有可重復(fù)性。

圖1 HPLC重復(fù)分離、熒光檢測標準品峰值圖Fig.1 Replicated peak of standard were separated and detected by HPLCRed：the result from the first time;Blue：the result from the fifth time;HPLC：high performance liquid chromatography;CySS：cystine;Cys：cysteine;γ-GG：glutamylglutamateGSH：reduced glutathione;GSSG：oxideided glucathione.

表2 重復(fù)性實驗Tab.2 Repeatability of the assay

2.2 標準樣品的穩(wěn)定性檢測

分別測定新鮮配制的標準樣品與配制后置入－20℃保存90d的標準品，并對第1天和第90天的樣品濃度進行檢測，記錄峰面積，計算RSD值。經(jīng)較長時間凍存后，與新鮮制備的標準樣品相比，GSH、GSSG、Cys、CySS的 RSD值分別為 7.5%，6.9%，6.4%和3.9%均小于10%，表明本方法制備的標準樣品在－20℃環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 血漿樣品中Cys/CySS和GSH/GSSG的檢測

根據(jù)血漿樣品的制備方法1.2中3)制備HPLC大鼠血漿樣品，并按照1.3實驗方法分別檢測混合標準樣品、正常大鼠及帕金森大鼠模型的血漿樣品中Cys、 CySS、GSH、GSSG的含量，詳見圖2。利用內(nèi)標法公式：

內(nèi)標γ-GG(10μmol/L)，標準樣品中各物質(zhì)的濃度(5μmol/L)，可 分 別 計 算 正 常 大 鼠 中 Cys (20.68 μmol/L)、 CySS (34.00μmol/L)、 GSH (25.3μmol/L)、GSSG(15.8μmol/L)和帕金森模型大鼠中 Cys(22.99μmol/L)、CySS(28.55μmol/L)、GSH (7.8μmol/L)、GSSG(18.5μmol/L)的含量。帕金森大鼠模型動物血漿中可能存在氧化還原電勢的改變。

圖2 HPLC分離、熒光檢測大鼠血漿中Cys，CySS，GSH，GSSG峰值圖Fig.2 Peaks of Cys，CySS，GSH，GSSG，in rat plasma were separated and detected by HPLCA：standard mixture containing each of Cys，CySS，GSH，GSSG at 5μmol/L and 10μmol/L internal standard，γ-GG;B：plasma sample from a healthy rat;C：plasma sample from a rat with Parkinson's disease;HPLC：high performance liquid chromatography;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione; GSSG：oxidized glutathione.

2.4 樣品中氧化還原電勢的計算

根據(jù)圖2中各實驗組測得的各組分的濃度，利用能斯特方程：Cys/CySSEh=－250+30 log［(CySS)/ (Cys)2］，GSH/GSSGEh=－264+30 log［(GSSG)/ (GSH)2)分別計算大鼠血漿樣品中的氧化還原電勢(圖3)。當血漿pH值為7.4時，正常大鼠的Cys/ CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－120.01±18.08) mV和(－131.60±2.45)mV，而在帕金森大鼠動物模型中Cys/CySSEh和GSH/GSSGEh分別為(－96.34± 9.98)mV和(－94.27±4.56)mV。與正常大鼠相比，帕金森大鼠動物模型血漿中 Cys/CySSEh和 GSH/ GSSGEh均發(fā)生了一定程度的氧化，進一步量化了帕金森大鼠動物模型中的氧化應(yīng)激程度。

圖3 不同組間大鼠Eh值柱狀圖Fig.3 Histograms of rat plasma Eh in different experimental groupsControl：rats injected with DMSO;Model：rotenone-induced rat model of PD;male Sprague-Dawley rats received rotenone(6 μg) injection for 3 weeks;Eh：redox potentials;Cys：cysteine;CySS：cystine;GSH：reduced glutathione;GSSG：oxidized glutathione.

3 討論

含巰基/二硫鍵化合物在體內(nèi)分布廣泛，其多功能性也越來越引起廣泛的注意。特別是近年來，活性氧、自由基以及氧化還原調(diào)控在體內(nèi)的研究尤為重要［11］。目前國內(nèi)文獻［12］報道的方法主要集中在用HPLC檢測血漿中還原態(tài)物質(zhì)如GSH、Cys等的含量，未涉及相應(yīng)氧化還原電勢的檢測。此外，疾病狀態(tài)下Cys/CySSEh與GSH/GSSGEh并非同時發(fā)生變化［13］，因此單獨檢測其中之一有可能對實驗的準確性造成影響。而本方法可同時測定血漿內(nèi)氧化態(tài)和還原態(tài)物質(zhì)Cys、CySS、GSH、GSSG的含量，并可反映機體氧化還原能力重要的量化指標(氧化還原電勢)。此方法的建立，為研究巰基依賴的氧化還原相關(guān)信號［1］提供了更加可靠的依據(jù)。

利用本研究方法制備樣品時應(yīng)注意以下幾點：第一，在－20℃條件下，可維持樣品的穩(wěn)定性4～5個月，樣品在－80℃條件下，則可穩(wěn)定更長時間;第二，在樣品制備過程中用到的高氯酸，有k+存在時會出現(xiàn)沉淀，因此在制備好的樣品中如出現(xiàn)少量沉淀，并不會影響實驗結(jié)果的準確性;第三，為保證色譜柱的使用壽命，可在上機操作前，適當離心棄去沉淀;第四，本研究所用方法是基于陰離子交換柱的原理建立的，帶有不同負電荷的待測樣品可以被梯度洗脫下來。因此實驗成功的關(guān)鍵在于流動相Ⅰ與Ⅱ的比例。決定該比例的主要因素，除樣品所帶電荷數(shù)以外，還有色譜柱的柱齡。我們經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，隨著柱齡的增加，待測樣品與色譜柱的結(jié)合能力逐漸減弱，為了能夠繼續(xù)達到較好的分離效果，保證實驗結(jié)果的準確性，可逐漸降低流動相中Ⅱ所占的比例。此外，在制備待測樣品的過程中，防止樣品制備過程中溶血現(xiàn)象的發(fā)生是實驗成功的另一關(guān)鍵部分。因為紅細胞中GSH的含量較血漿中高出很多。一旦樣品制備過程中出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，樣品需丟棄，否則將嚴重影響實驗的準確性。

此方法可被廣泛用于測定與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病，如肝損傷［14］、動脈粥樣硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、皮膚病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［15-17］等，以及在不同營養(yǎng)狀態(tài)和不同毒理學(xué)條件下，血漿、支氣管肺泡灌洗液、淋巴液、腦脊液中Cys/CySS和GSH/GSSG氧化還原對的含量及相應(yīng)的氧化還原電勢，因而可成為檢測與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病及病理條件下的新的臨床診斷指標之一。

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