農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 胡小媛 滕 達(dá)＊ 張 勇 王建華＊

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因室

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黃建忠＊

布拉酵母（Saccharomyces boulardii）于 20 世紀(jì)20年代由法國微生物學(xué)家Henri Boulard首次發(fā)現(xiàn)并分離，后被確認(rèn)為釀酒酵母的一個亞種（Canani等，2011）。與普通釀酒酵母比，布拉酵母更具有作為益生菌的生物學(xué)優(yōu)勢，如其耐高溫（在37℃生長良好）和耐酸性環(huán)境（在pH為2環(huán)境下1 h后細(xì)胞存活率仍能達(dá)到75%）（Edwards-Ingram 等，2007；Fietto 等，2004）。布拉酵母具有緩解腹瀉癥狀的獨(dú)特作用。有研究報(bào)道，日糧中同時添加中乳酸菌、芽孢桿菌及布拉酵母組的斷奶仔豬2周后腹瀉率比對照組 （只飼喂日糧組）降低74%，而只添加乳酸菌和芽孢桿菌腹瀉率僅比對照組降低42%，說明布拉酵母具有防治畜禽腹瀉的獨(dú)特效果（Giang等，2012）。但目前關(guān)于其防腹瀉機(jī)制的尚不十分清晰,本文就布拉酵母抗腹瀉作用機(jī)制作一綜述。

1 抗微生物作用

1.1 分泌抗毒素物質(zhì) 布拉酵母能產(chǎn)生幾種特異抗病原菌毒素蛋白，從而可防止由病原菌毒素引起的腹瀉。目前已從布拉酵母發(fā)酵液中分離出三種抗毒素蛋白。第一種為54 kDa絲氨酸蛋白酶，能降解難辨梭菌（Clostridium diffcile）產(chǎn)生的兩個蛋白外毒素（毒素A和毒素B）及毒素A在結(jié)腸上的刷狀緣膜受體，從而抑制兩種毒素對腸細(xì)胞表面的結(jié)合，保護(hù)腸道免受毒素侵害（Castagliuolo 等，1999）。第二種蛋白為 120 kDa 蛋白，其作用是中和霍亂弧菌（Vibrio cholera）產(chǎn)生的霍亂毒素（CT），抑制CT對腸細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶的激活，降低cAMP過度分泌，減少氯離子流失，從而維持細(xì)胞正常滲透壓，避免水分大量流失（Czerucka和Rampal，1999）。 第三種蛋白為 63 kDa堿性磷酸酶，其作用是通過去磷酸化作用抑制大腸桿菌內(nèi)毒素活性（Buts等，2006）。

1.2 抑制黏附宿主細(xì)胞表面 布拉酵母通過提供病原菌黏附受體或分泌一些物質(zhì)抑制病原菌對宿主的黏附。某些腸道病原菌能黏附在腸道黏膜上皮細(xì)胞表面。例如，大腸桿菌和沙門氏菌通常通過I型菌毛凝集素識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面特異性糖類受體，進(jìn)而定植于腸道壁上，在腸道繁殖并分泌毒素，從而引起疾病（Badia等，2012a；Martins等，2010）。阻止病原菌與腸道上皮細(xì)胞的黏附，可以防止大部分細(xì)菌感染發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁成分可以作為抗黏附劑，其作用是通過提供替代黏附位點(diǎn)以防止某些腸道細(xì)菌的黏附，這種抗黏附策略適用于具有甘露糖特異I型菌毛的腸道細(xì)菌，如大腸桿菌或沙門氏菌屬 （Ganner和Schatzmayr，2012）。布拉酵母細(xì)胞壁中的甘露寡糖與腸上皮細(xì)胞黏附位點(diǎn)極其相似，從而使病原菌黏附于布拉酵母細(xì)胞表面，從而阻止病原菌對宿主細(xì)胞表面的黏附。而對于不依賴I型菌毛黏附宿主細(xì)胞病原菌，布拉酵母也可對其進(jìn)行干擾，如具F4菌毛的腸毒性大腸桿菌（ETEC）K88對甘露糖具有耐受性（Devriendt等，2010），但可特異性識別β-半乳糖殘基，布拉酵母含豐富的β-半乳糖殘基，可與ETEC K88的F4黏附素結(jié)合，使其黏附到布拉酵母細(xì)胞表面，試驗(yàn)表明，用布拉酵母（MOI=3）或 β-半乳甘露聚糖（10μg/mL）處理，使得ETEC K88 GN1034對豬小腸上皮細(xì)胞系IPI-2I黏附率比對照下降 80%（Badia等，2012b）。Murzyn等（2010a）發(fā)現(xiàn)，布拉酵母細(xì)胞及其發(fā)酵液提取物均可抑制白色念珠菌對人腸細(xì)胞系Caco-2和Intestin 407的黏附，認(rèn)為其機(jī)制為布拉酵母分泌癸酸，抑制白色念珠菌菌絲體形成，影響生物膜的形成，從而降低白色念珠菌對腸細(xì)胞的黏附。同時經(jīng)過癸酸和布拉酵母提取物處理白色念珠菌后用實(shí)時定量PCR檢測其毒性相關(guān)基因的表達(dá)譜，結(jié)果顯示，HWP1、INO1及CSH1表達(dá)有所降低（Murzyn 等，2010b）。

1.3 抑制侵入宿主細(xì)胞 某些細(xì)菌致病的一個重要步驟是侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，布拉酵母可通過維持腸道屏障功能或阻礙病原菌運(yùn)動從而阻止病原菌侵入宿主細(xì)胞。例如，致病性大腸桿菌（EPEC）感染T84細(xì)胞后，細(xì)胞通透性提高，緊密連接相關(guān)蛋白zonula occluden（ZO）-1分布改變，布拉酵母可通過增強(qiáng)受感染細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，延遲受感染細(xì)胞凋亡，沒有改變黏附細(xì)胞的數(shù)量但使細(xì)胞內(nèi) EPEC數(shù)量減少 50%（Czerucka等，2000）。 Martins等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，用鼠傷寒沙門氏菌處理T84細(xì)胞，導(dǎo)致跨上皮電阻減少，通透性提高，而用布拉酵母和鼠傷寒沙門氏菌混合處理T84細(xì)胞，其跨上皮電阻和細(xì)胞通透性均維持正常狀態(tài)，說明布拉酵母能保護(hù)細(xì)胞屏障功能，從而阻止病原菌侵入宿主細(xì)胞。Mumy等（2008）研究結(jié)果顯示，布拉酵母雖不能抑制志賀氏菌黏附及侵入宿主細(xì)胞，但通過影響緊密連接相關(guān)蛋白zonula occluden-2，增強(qiáng)腸上皮屏障完整性，從而減輕炎癥。此外，運(yùn)動性利于細(xì)菌侵入細(xì)胞，例如，在腸道內(nèi)，細(xì)菌可通過鞭毛運(yùn)動穿過黏膜侵入到腸細(xì)胞內(nèi)部。Pontier等（2012）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌1344單獨(dú)與人結(jié)腸細(xì)胞T84培養(yǎng)時，其平均曲線運(yùn)動速度（CLV）為 43.3 mm/s，當(dāng)有布拉酵母存在時，其CLV降為31.2 mm/s，可見，布拉酵母改變了細(xì)菌運(yùn)動速度。進(jìn)一步通過非運(yùn)動鞭毛缺陷性鼠傷寒沙門氏菌的運(yùn)動和入侵相關(guān)性研究表明布拉酵母可改變鼠傷寒沙門氏菌的運(yùn)動和軌跡，或許可以解釋布拉酵母能夠影響沙門氏菌的入侵機(jī)制。

2 免疫調(diào)節(jié)作用

2.1 調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞信號及炎性因子表達(dá) 布拉酵母幫助機(jī)體對抗病原性腹瀉的另一個重要機(jī)制是提高宿主腸黏膜免疫反應(yīng)。大腸桿菌、沙門氏菌、難辨梭菌、志賀氏菌等病原菌結(jié)合腸上皮細(xì)胞膜表面受體（如 Toll like receptors，TLRs），激活宿主細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）等。MAPK主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶ERK1/2、p38激酶及JNK激酶，是參與轉(zhuǎn)錄因子激活及其他細(xì)胞效應(yīng)信號通路的重要分子（Robinson 和 Cobb，1997）。 NF-κB 可調(diào)控許多炎癥因子的表達(dá)，是許多細(xì)胞包括腸上皮細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的最重要調(diào)控者。正常情況下，NF-κB與抑制劑IκB結(jié)合，當(dāng)受到炎性細(xì)胞因子、細(xì)菌或細(xì)菌產(chǎn)物刺激后，IκB降解，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核激活某些炎性細(xì)胞因子 （如白細(xì)胞介素IL-8基因、腫瘤壞死因子TNFα等）的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引起機(jī)體炎癥反應(yīng) （Pothoulakis，2009；Mumy 等，2008）。布拉酵母破壞MAPK活性，干擾NF-κB介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而減少IL-8表達(dá)，增加抗炎性細(xì)胞因子（如IL-4和IL-10）表達(dá)，從而保護(hù)機(jī)體免受炎癥性腹瀉 （Canani等，2011；Fidan 等，2009；Chen，2006）。

Dahan等（2003）研究結(jié)果顯示，腸出血性大腸桿菌EHEC能促進(jìn)結(jié)腸腺癌T84細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑IκBα降解，進(jìn)而提高NF-κB DNA結(jié)合活性，去除EHEC引起的肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，同時激活ERK1/2和p38激酶，介導(dǎo)IL-8大量表達(dá)。T84細(xì)胞感染EHEC前用布拉酵母處理可抑制IκBα降解，降低NF-κB DNA結(jié)合活性，減少IL-8分泌。Martins等（2010）先用鼠傷寒沙門氏菌感染T84細(xì)胞導(dǎo)致IL-8大量分泌，再用布拉酵母處理，結(jié)果IL-8分泌顯著減少，但MAPK及NF-κB的活性未受到影響，且IL-8 mRNA水平?jīng)]有減少；在鼠傷寒沙門氏菌感染T84細(xì)胞之前先用布拉酵母處理，則JNK、ERK1/2及NF-κB活性均受到抑制，且IL-8在mRNA水平和分泌水平上均降至正常水平，說明布拉酵母在轉(zhuǎn)錄及翻譯階段都影響IL-8表達(dá)。熱處理布拉酵母，則喪失抑制MAPK效果，但其細(xì)胞壁懸浮液仍具抑制能力，表明在布拉酵母細(xì)胞壁上有抑制MAPK的物質(zhì)存在。

腸上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)有重要作用（Rimoldi等，2005）。最近研究結(jié)果顯示，在豬腸上皮細(xì)胞IECs中，布拉酵母能在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上抑制沙門氏菌對炎癥細(xì)胞因子，如 TNF-α、IL-1α、IL-6，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）及趨化因子等的誘導(dǎo)作用。在樹突狀細(xì)胞（DC）中，布拉酵母與沙門氏菌同時處理組與僅用沙門氏菌處理組相比，TNF-α、GMCSF及趨化因子CXCL8轉(zhuǎn)錄水平略有提高，說明DC可能被布拉酵母激活，但在腸毒素大腸桿菌ETEC感染DC的情況下，布拉酵母對DC激活無影響，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究 （Badia等，2012）。Thomas等（2009）研究結(jié)果顯示，布拉酵母通過調(diào)節(jié)DC形態(tài)、功能及遷移，抑制DC對LPS的免疫反應(yīng)，從而抗炎癥。

布拉酵母還可促進(jìn)過氧化物酶體增殖激活受體-γ（PPAR-γ）表達(dá)，PPAR-γ 是一種核受體，在結(jié)腸上皮細(xì)胞中對炎性細(xì)胞因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄具有重要作用，若干擾PPAR-γ表達(dá)，將會減弱布拉酵母對IL-8表達(dá)的抑制作用，說明PPAR-γ在布拉酵母阻斷IL-8表達(dá)中起重要作用 （Lee等，2008）。除了布拉酵母細(xì)胞可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，其發(fā)酵上清也具有此功能（Mumy等，2008）。研究表明，布拉酵母產(chǎn)生的一種小分子（<1 kDa）、可溶于水且熱穩(wěn)定的抗炎癥因子SAIF，可干擾LPS、IL-1b及TNF-a對NF-κB的激活，進(jìn)而抑制NF-κB對IL-8基因表達(dá)的激活，抑制IL-8在腸表皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中的表達(dá)（Sougioultzis等，2006）。

2.2 促進(jìn)抗體產(chǎn)生 IgA是機(jī)體黏膜免疫中非常重要的一種抗體，它可以抵抗黏附在腸黏膜上的病原菌（Martins 等，2009）。 Qamar等（2001）用布拉酵母對預(yù)先經(jīng)難辨梭菌類毒素A處理的小鼠進(jìn)行灌胃，使小腸總IgA量提高1.8倍，IgA特異抗毒素A水平提高4倍，表明布拉酵母可促進(jìn)機(jī)體免疫球蛋白IgA產(chǎn)生，增強(qiáng)腸道免疫反應(yīng)，從而有效防治腹瀉。

3 調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境

抗生素治療引起腸道菌群比例失調(diào)，導(dǎo)致腹瀉，被稱為抗生素相關(guān)腹瀉（AAD）。腸道菌群比例失調(diào)導(dǎo)致腸道微生物有益代謝活動減少。例如，膽鹽代謝、短鏈脂肪酸SCFA分泌顯著減少，引起腸道微生態(tài)失衡，一些致病菌，如產(chǎn)酸克雷伯菌和難辨梭菌等會乘機(jī)大量繁殖。Barc等（2008）采用菌群特異性16S rRNA熒光原位雜交結(jié)合流式細(xì)胞儀定量分析對口服阿莫西林克拉維酸小鼠腸道中真菌、溶組織梭菌、腸道桿菌群、雙歧桿菌屬等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗生素處理后接受布拉酵母處理的小鼠能快速恢復(fù)腸道菌群平衡，比對照組提前1～2周，腹瀉療程縮短。此外，有試驗(yàn)表明，布拉酵母還能釋放多胺到腸腔中，如亞精胺和精胺水平分別提高21.4%和21.9%，進(jìn)而提高微絨毛中刷狀緣膜酶，包括乳糖酶、蔗糖酶、異麥芽糖酶等雙糖酶的分泌，從而促進(jìn)腸絨毛生長，改善機(jī)體消化吸收能力，提高抗體對抗病原體能力（Buts，2008；Buts等，1994）。

4 小結(jié)

綜上所述，已有大量動物試驗(yàn)及臨床研究證明布拉酵母對腸道疾病的療效。但相關(guān)藥代動力學(xué)方面的系統(tǒng)研究明顯欠缺，并且涉及該菌在腸道發(fā)揮作用的有效劑量、時間，與其他微生態(tài)制劑或藥物互作配伍關(guān)系等問題均需進(jìn)一步研究。此外，由于布拉酵母不耐膽鹽以及抗凍能力差，以至于基于細(xì)胞保活目標(biāo)的包被保護(hù)等制劑技術(shù)已然成為飼料領(lǐng)域應(yīng)用瓶頸急待突破。總之，有必要夯實(shí)相關(guān)理論和應(yīng)用研究，進(jìn)一步明確作用機(jī)制、拓寬適用范圍、提高應(yīng)用實(shí)效，以為推動布拉酵母作為飼料抗生素替代品的有益嘗試提供必要的理論支持。

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