全桂靜， 邢繼雙

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽110142)

食用色素是指能使食品著色或改善食品色調(diào)和色澤的食品添加劑［1］.它在食品中的含量非常少，但對(duì)食品質(zhì)量及品質(zhì)的影響非常大，是食品工業(yè)中不可缺少的添加劑之一.天然食用色素色澤自然、種類繁多、安全性高，食用天然色素已被廣泛應(yīng)用于飲料、糖果等食品的著色［2］.研究表明，一些食用天然色素對(duì)人體的多種疾病還具有非常突出的治療、預(yù)防等藥理作用和保健功能，也可用于醫(yī)療保健品、化妝品的著色，能更好地模仿天然物的顏色，著色時(shí)的色調(diào)比較自然［3］.利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)功能性食用天然色素，因其產(chǎn)率高、不受原料產(chǎn)地制約等優(yōu)勢，逐漸成為當(dāng)前研究熱點(diǎn).目前我國準(zhǔn)許使用的色素中，藍(lán)色素主要是從桅子、螺旋藻、念珠藻、紫甘藍(lán)等原料中提取，并對(duì)其性質(zhì)、穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，但發(fā)酵生產(chǎn)藍(lán)色素卻不多見［4］.因此，開發(fā)和選育出能大量生產(chǎn)天然藍(lán)色素的微生物具有一定意義.本文從土壤中篩選出1株藍(lán)色素高產(chǎn)菌株產(chǎn)量穩(wěn)定，以期可以豐富食用藍(lán)色素的物種.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

沈陽化工大學(xué)院內(nèi)土壤.

1.1.2 培養(yǎng)基配方

(1)初篩培養(yǎng)基(g/L)［4－5］

可溶性淀粉 20，KNO31.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2Cr2O70.1，瓊脂20，pH=7.5，121℃高壓蒸汽滅菌30 min.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，pH=7.5，121℃高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)色素產(chǎn)生菌株的篩選

(1)初篩:采用10倍稀釋法對(duì)土樣進(jìn)行充分稀釋.將初篩培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿，凝固制成平板.取1 mL稀釋液涂布于平板上，30℃恒溫培養(yǎng)96 h.

(2)復(fù)篩［5］:初篩的菌株轉(zhuǎn)接斜面后，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30℃培養(yǎng)5 d，制成108/mL單孢子懸液.取1 mL懸液接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中，30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)96 h，測定色素產(chǎn)量.

1.2.2 藍(lán)色素產(chǎn)量的測定方法［5－6］

發(fā)酵液采用sigma 2-16P臺(tái)式高速離心機(jī)5 000 r/min離心30 min，取上清液.以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，利用722型分光光度計(jì)在590 nm波長處測A值［5］，以表示發(fā)酵液中色素的產(chǎn)量.

1.2.3 藍(lán)色素生產(chǎn)條件的研究［5－7］

(1)營養(yǎng)條件的研究:利用常用的糖類及無機(jī)、有機(jī)含氮化合物分別作為碳源和氮源，250 mL三角瓶中裝100 mL液體培養(yǎng)基，按2%比例接種，在30℃，160 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)96 h，確定適宜的營養(yǎng)條件.

(2)發(fā)酵條件的優(yōu)化:在確定營養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，考察溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)色素生產(chǎn)的影響，以優(yōu)化發(fā)酵條件.

(3)正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì):根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

(4)正交試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn):按以上正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)配比，進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)試驗(yàn).

1.2.4 藍(lán)色素的提取與色價(jià)測定

(1)色素的提取:向90 mL色素粗溶液中滴加2 mol/L的NaOH溶液10 mL，在50℃恒溫水浴鍋中作用30 min使色素充分沉淀，采用sigma 2-16P臺(tái)式高速離心機(jī)7 800 r/min離心30 min后，干燥即得色素粗提物.

(2)粗提物色價(jià)的測定:按1∶100的比例用pH9.0Tris-HCl緩沖溶液溶解色素粗提物，使色素充分溶解［8－9］，用722型可見分光光度計(jì)在波長590 nm處測吸光度.按公式

計(jì)算色價(jià)［10］.式中，A為實(shí)測試樣的吸光度;α為稀釋倍數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)色素生產(chǎn)菌株的篩選

2.1.1 初篩

土樣經(jīng)稀釋并在初篩培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)后，共篩得7株產(chǎn)水溶性藍(lán)色素的放線菌，見圖1.

圖1 藍(lán)色素產(chǎn)生菌株的菌苔Fig.1 The lawn of blue pigment producing strain

2.1.2 復(fù)篩

對(duì)初篩得到的7株菌進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵液離心后測A590，結(jié)果見表2.由表2可知5號(hào)菌株發(fā)酵液的A590值較高，命名為Cya-5.

表2 初篩菌株的藍(lán)色素產(chǎn)量Table 2 The blue pigment production of the screening strains

2.2 藍(lán)色素生產(chǎn)條件的研究結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響

以20 g/L的蔗糖、甘油、葡萄糖、檸檬酸三鈉、可溶性淀粉等作為碳源，1 g/L的KNO3為氮源，研究藍(lán)色素的發(fā)酵情況，結(jié)果見圖2.

圖2 碳源對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響Fig.2 The effect of carbon source on the pigment fermentation

由圖2結(jié)果可知，碳源對(duì)藍(lán)色素發(fā)酵生產(chǎn)的影響較大，其中以甘油為碳源時(shí)，A590最大為5.01，可溶性淀粉次之.因此確定甘油為藍(lán)色素發(fā)酵用碳源.

2.2.2 氮源對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響

確定碳源為甘油后，以1 g/L蛋白胨，硫酸銨，硝酸鉀作為氮源，以及不加氮源，研究藍(lán)色素產(chǎn)量，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，以KNO3為氮源時(shí)，A590最大為5.32，可見KNO3有利于藍(lán)色素的生產(chǎn).

圖3 氮源對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響Fig.3 The effect of nitrogen source on the pigment fermentation

2.2.3 發(fā)酵液初始pH值對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響

配制培養(yǎng)基時(shí)，調(diào)節(jié)不同的pH值，研究初始pH對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4.結(jié)果顯示，pH對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響較大，當(dāng)pH在8.0左右時(shí)，A590最大為5.98.這與放線菌的最適生長pH范圍7.5～8.5基本一致.

圖4 初始pH對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響Fig.4 The effect of initial pH on the pigment fermentation

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響

在最適碳源、氮源、pH值的條件下，考察發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)色素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5所示.由圖5可以看出:當(dāng)發(fā)酵溫度為30～35℃時(shí)，色素產(chǎn)量和胞外分泌率都是比較好的，但尤以30℃為最佳.當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，該放線菌基本不產(chǎn)藍(lán)色素.

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響Fig.5 The effect of temperature on the pigment fermentation

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響

在以甘油為碳源，硝酸鉀為氮源，pH=8.0，30℃發(fā)酵，測量不同發(fā)酵時(shí)間藍(lán)色素的產(chǎn)量，結(jié)果如圖6所示.由圖6結(jié)果可知，發(fā)酵96 h時(shí)，A590達(dá)到最大值為5.96，因此96 h為藍(lán)色素的最佳收獲時(shí)間.

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)藍(lán)色素生產(chǎn)的影響Fig.6 The effect of fermentation time on the pigment fermentation

2.2.6 正交試驗(yàn)

按4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液預(yù)處理后，經(jīng)過10倍稀釋后測定A590，結(jié)果及分析見表3.結(jié)果顯示最佳組合為A2B2C3D2，即最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:甘油20 g/L，KNO31 g/L，pH值為8.5，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，總A值可達(dá)12.02.數(shù)據(jù)分析顯示，在研究的4個(gè)因素中，對(duì)發(fā)酵影響最大的因素是氮源濃度，其次為碳源濃度.

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 Results of orthogonal experiment

按上述正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)配比，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理后，稀釋10倍后測定A590，發(fā)酵中藍(lán)色素產(chǎn)量基本穩(wěn)定，總A590在12.24左右.

2.3 藍(lán)色素粗提物的性狀及色價(jià)

用2 mol/L NaOH提取，藍(lán)色素粗提物的平均得率為64.1 g/100 L.粗提物為不均勻的黑藍(lán)色片狀顆粒.關(guān)于微生物藍(lán)色素的報(bào)道中多為粗溶液的研究，僅有報(bào)道的藍(lán)色素粗提物為紫紅色素粉末［11］，本實(shí)驗(yàn)提取得到的色素為新物質(zhì).

在堿性條件下加熱攪拌，促進(jìn)粗色素溶液中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)與色素分子結(jié)合，并發(fā)生沉淀，形成粗提物.將色素粗提物用pH=9.0的緩沖溶液溶解，出現(xiàn)少量的不溶物，溶液在590 nm處測定A值，根據(jù)公式計(jì)算色價(jià)為45.8.

3 結(jié)論

利用初篩培養(yǎng)基從土壤中篩選得到7株能產(chǎn)生藍(lán)色素的放線菌，其菌落及周圍培養(yǎng)基中擴(kuò)散有大量水溶性的藍(lán)色素.利用液體發(fā)酵法對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩，其中有2株放線菌無色素產(chǎn)生，另有1株放線菌的產(chǎn)量突出，命名為cya-5.

對(duì)cya-5的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示藍(lán)色素生產(chǎn)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為甘油20 g/L、KNO31 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.5 g/L，初始pH值為8.5，其中氮源濃度和碳源濃度對(duì)色素產(chǎn)量影響較大;培養(yǎng)溫度為30℃，裝液量為100 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間為96 h，發(fā)酵液的A590值可達(dá)12.02，與張和春等研究的分泌色素量相比較，略高.

堿沉發(fā)酵液得到不均勻的黑藍(lán)色片狀色素物質(zhì)，該物質(zhì)比較穩(wěn)定，溶解于pH=9的水溶液呈現(xiàn)深藍(lán)色.通過測定，該色素粗提物的色價(jià)為45.8，較市售的梔子藍(lán)色素的色價(jià)低，主要原因?yàn)榇痔嵛锏募兌炔粔?，在以后的研究工作中?yīng)進(jìn)一步純化.

［1］ 張國文.食用色素的研究現(xiàn)狀與前景［J］.糧油食品科技，2004，12(6):17－19.

［2］ 毛得獎(jiǎng)，朱亞玲.我國天然藍(lán)色素研究現(xiàn)狀［J］.中國食品添加劑，2011，36(10):109－114.

［3］ 車雙輝，杜琪珍，夏明.天然藍(lán)色素的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2003，24(2):18－20.

［4］ 趙輝，閆華曉.一株產(chǎn)藍(lán)色素海洋鏈霉菌及其色素性質(zhì)的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(6): 186－188.

［5］ 張和春.天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)藍(lán)色素的搖瓶發(fā)酵優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵，1999，25(5):23－27.

［6］ 陸玲，孫延濤，唐勇，等.一種放線菌發(fā)酵產(chǎn)天然藍(lán)色素的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28(4):50－54.

［7］ 趙東紅，陸玲，秦懷蘭.一種微生物發(fā)酵產(chǎn)藍(lán)色素的穩(wěn)定性及毒性研究［J］.食品與發(fā)酵，1998，24 (5):21－24.

［8］ 張和春，陳亮，季文明，等.產(chǎn)藍(lán)色素放線菌的初步鑒定和藍(lán)色素性質(zhì)研究［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18(3):23－28.

［9］ 徐尤智，梁華正，陳賀，等.高色價(jià)梔子藍(lán)色素的制備及其穩(wěn)定性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27 (4):440－443.

［10］孫平.食品添加劑［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2004:99－100.

［11］李一葦，陳曉琳，張明.一株產(chǎn)藍(lán)色素菌株生物學(xué)特性及色素基本性質(zhì)的研究［J］.生物學(xué)雜志2007，24(1):41－43.