王少庸 王振月 陳立超 郭 美 劉 奐 王宗權(quán) 唐先明

（黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院· 哈爾濱 150040）

植物中藥用有效成分主要為植物的次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物在處理植物與生態(tài)環(huán)境關(guān)系上充當著重要的角色[1,2]。次生代謝實際上是植物在長期進化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果，在某種程度上，次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和變化比初生代謝產(chǎn)物與環(huán)境有著更強的相關(guān)性和對應(yīng)性[3-6]。對于環(huán)境因子影響植物次生代謝產(chǎn)物的探討，常?？梢詾槟承┚哂兄匾幱煤徒?jīng)濟價值的次生代謝產(chǎn)物的高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實踐指導，因而這方面的研究工作顯得尤為重要。

毛脈酸模（Rumex gmelini Turcz.）為蓼科（Polyonaceae）酸模屬多年生宿根草本植物，因其根中含有具有抗癌、抗病毒、防止心血管疾病等顯著功效的重要次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇及白藜蘆醇苷[7]，而逐漸被研究人員所關(guān)注。目前關(guān)于毛脈酸模的資源調(diào)查、次生代謝產(chǎn)物（化學成分）的提取、分離、結(jié)構(gòu)確定及含量測定分析等方面已有一些研究工作[8-12]。但光質(zhì)對毛脈酸模根中的次生代謝產(chǎn)物的影響至今未見報道。為此，我們通過人工栽培實驗，研究了光質(zhì)對毛脈酸模根中白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的影響。本項研究不僅對在生產(chǎn)實踐中提高毛脈酸模根中重要次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率具有重要意義，而且可以為研究植物次生代謝的途徑和機理提供依據(jù)。

1 儀器與材料

美國Waters高效液相色譜儀（Waters 2695型泵，2996型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站）；Mettler電子天平AE 240；ZK-82B型真空干燥箱（上海市實驗儀器總廠）。

白藜蘆醇及白藜蘆醇苷的對照品均由美國Sigma公司提供。甲醇，色譜純，美國DIKMA試劑公司提供；磷酸，分析純，天津市天河化學試劑廠出品；水，娃哈哈純凈水。

毛脈酸模根樣品采于黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園。光質(zhì)處理組中，紅色、藍色、綠色、黃色濾光膜其相對光強為全光照的53%、52%、50%、60%，遮蔭組相對光強為全光照的51%。

2 實驗方法

2.1 樣品處理

對一年生及二年生毛脈酸模植株進行遮膜處理。遮膜處理組在四周靠近地面處留有通風空隙，并依照日光組的含水量適時澆水，保持土壤含水量基本相等。

2.2 樣品采集

處理后每隔15天采樣1次，共采樣5次，每個處理組采樣9株。

2.3 色譜條件

Planetsil C18 分析柱（5μm，200mm×4.6mm），預柱 Phenomenex ODS-C18(4×3.0mm)；流動相：流動相A為甲醇，流動相B為水（磷酸調(diào)pH為2.0）；線性梯度洗脫條件：流動相從甲醇30%到100%甲醇，時間為0-50 min；流速1 mL·min-1；檢測波長：303 nm ；柱溫：40℃；進樣量：20μL。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取白藜蘆醇、白藜蘆醇苷對照品適量，溶于甲醇配制成濃度依次為0.11，0.66mg/ml的標準溶液，分別精密吸取標準溶液，注入高效液相色譜儀，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見表1。

表1 樣品線性關(guān)系Tab1 Calibration curves of references

2.5 供試品溶液的制備

毛脈酸模根部陰干后，粉碎過80目篩，在50℃下干燥至恒重。每個樣品精密稱取0.5g，置索氏提取器內(nèi)加50%乙醇70ml提取4h，濾過，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干。殘渣用25ml甲醇溶解并定容至刻度，此溶液再過0.45μm的微孔濾膜，棄去初濾液取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，連續(xù)進樣5次，以白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的峰面積計算,其RSD＜1.0%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別在0h，2h，6h，18h和24h進樣測試，結(jié)果顯示，按所檢測的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的峰面積計算，其RSD＜3.0%。表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性試驗

取同一樣品粉末5份，每份精密稱取0.5g，按“2.5”項下制成供試品溶液5份，各取20μL進行測定，以白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的峰面積計算，其RSD＜3.0%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知白藜蘆醇苷含量的樣品粉末（過80目篩）5份，精密加入白藜蘆醇苷對照品適量，按“2.5”項下制備供試品溶液，測定結(jié)果表明，回收率依次為100.31%，99.81%，99.12%，99.45%，103.30%，其平均回收率為100.40%，RSD＜2.0%。

2.10 樣品含量測定

各樣品按“2.5”制成供試品溶液，精密吸取各樣品的供試液20μl，注入高效液相色譜儀，測得不同樣品中的白藜蘆醇、白藜蘆醇苷含量，結(jié)果見圖1-4。利用SPSS軟件，對上述含量測定結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 光質(zhì)對一年生毛脈酸模根中白藜蘆醇及其苷含量的影響

遮蔭和不同光質(zhì)對一年生毛脈酸模根中白藜蘆醇苷的含量有一定的影響。遮蔭處理的毛脈酸模，其根中的白藜蘆醇苷含量的變化趨勢與日光組相反，且在處理15d和30d時，白藜蘆醇苷的含量明顯高于日光組，而在其它處理天數(shù)45d、60d、75d其含量略低于日光組（圖1）。紅膜處理使毛脈酸模根中的白藜蘆醇苷含量顯著提高，整個處理時期含量均高于日光組和遮蔭組（圖1A）。藍膜處理的整個時期，除15d與日光組和遮蔭組相差不大外，其它時間白藜蘆醇苷含量均低于遮蔭組和日光組（圖1B）。綠膜處理15d可使該植物根中的白藜蘆醇苷的含量略高于遮蔭組和日光組，而其它處理時間其含量均低于日光組和遮蔭組（圖1C）。黃膜整個處理過程中，處理75d毛脈酸模根中的白藜蘆醇苷的含量明顯低于日光組，其它處理時間含量均在遮蔭和日光之間，且差別不大（圖1D）。

從圖2中可知，遮蔭對一年生毛脈酸模根中白藜蘆醇含量的影響較大，整個處理時期含量均高于日光組（圖2）。紅膜處理的毛脈酸模，其根中的白藜蘆醇的含量除30d與遮蔭組接近外，而其它處理時間其含量均高于日光組和遮蔭組（圖2A）。藍膜處理的整個時期內(nèi)，白藜蘆醇的含量均低于日光組和遮蔭組（圖2B）。綠膜整個處理時期變化趨勢與遮蔭相反，除60d、70d含量于日光組接近外，其它處理時間含量均高于日光組（圖2C）。黃膜處理的整個時期內(nèi)，白藜蘆醇的含量均低于日光組和遮蔭組（圖2D）。

從表2可見，紅膜處理的，其根中的白藜蘆醇及其苷的含量顯著高于日光組與遮蔭組；而其它3種濾光膜處理的均低于日光組和遮蔭組。

3.2 光質(zhì)對二年生毛脈酸模根中白藜蘆醇及其苷含量的影響

從圖3看出，遮蔭處理的毛脈酸模，其根中的白藜蘆醇含量的變化趨勢與日光組相似，含量差別不大（圖3）。紅膜處理30d、45d使毛脈酸模根中的白藜蘆醇含量高于日光組和遮蔭組，而其他處理時間含量低于日光組的和遮蔭組（圖3A）。藍膜處理整個時期含量波動不大（圖3B）。綠膜處理15d、30d該植物根中的白藜蘆醇的含量與日光組和遮蔭組相近，而其他處理時間其含量均低于日光組和遮蔭組（圖3C）。在黃膜的整個處理時期中，毛脈酸模根中的白藜蘆醇的含量的變化趨勢平穩(wěn)，且與日光組的變化趨勢相反（圖3D）。

從圖4可知，遮蔭組與空白組變化趨勢相似，且白藜蘆醇苷含量差別不大（圖4）。紅膜、藍膜、黃膜處理整個時期含量均低于日光組和遮蔭組（圖4A、B、D）。綠膜處理除30d

白藜蘆醇苷含量明顯低于日光組和遮蔭組外，其他處理時間含量與日光組和遮蔭組相近（圖4C）。

表2可知，日光組和遮蔭組白藜蘆醇和白藜蘆醇苷含量均顯著性高于4種濾光膜。

4 討 論

光質(zhì)是調(diào)節(jié)控制植物代謝的基本因素之一，它對植物的生長、形態(tài)結(jié)構(gòu)、光合作用和物質(zhì)代謝都具有一定的調(diào)控作用。大多數(shù)生物合成過程能通過改變光質(zhì)進行調(diào)節(jié)[13]。光合作用的增加能提供較多的次生代謝物前體，同時又抑制了次生代謝物的分解[14]。關(guān)于光質(zhì)對植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累方面的研究已有報道。光強和光質(zhì)對生物堿[15-17]、黃酮[18,14]、萜類內(nèi)酯[14]、揮發(fā)性成分[19]、糖苷[20]等次生代謝物質(zhì)影響。這些研究表明紅光強烈抑制黃酮的合成，藍光則相反[18]；藍光和黃光促進毛地黃葉組織培養(yǎng)物中強心苷的產(chǎn)生和積累，而紅光則抑制[21]；紅光較藍光更有利于懸浮培養(yǎng)細胞中阿瑪堿的生成[22]；光質(zhì)對2年生銀杏幼苗中銀杏黃酮苷的生物合成與積累影響較小[14]。已有研究表明紅膜處理的高山紅景天中的紅景天甙含量顯著高于對照，而黃膜對紅景天甙含量的抑制作用和藍膜的促進作用均不明顯[20]。

不同光質(zhì)作用于毛脈酸模植株，使其根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量發(fā)生變化，其中的作用機制有待于進一步研究。紅光處理可以顯著性提高一年生毛脈酸模根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，說明紅膜處理可能是通過某些途徑促進了次生代謝產(chǎn)物白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的生物合成。而4種濾光膜處理并沒有提高二年生毛脈酸模根中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，可能是由于其合成受到了抑制。

次生代謝是一個研究難度大但又極具潛力的研究領(lǐng)域。隨著對次生代謝生理生化及生態(tài)適應(yīng)方面認識的深入，以及分子生物學手段的滲透，植物次生代謝分子調(diào)控的研究發(fā)展迅速，人們已著手從次生代謝角度在分子水平上探討植物與環(huán)境因子的關(guān)系。因此，環(huán)境因子對植物次生代謝產(chǎn)物作用的研究，具有很大的理論和實踐意義。

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