劉曉露，劉勝利，郭立強(qiáng)，黃禮徳，黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色533000)

桑葚為?？浦参锷?Morus alba L).的干燥果穗。具有滋陰補(bǔ)血，生津潤燥。用于肝腎陰虛，眩暈耳鳴，心悸失眠，須發(fā)早白，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘［1］。目前，關(guān)于桑葚多糖藥理作用已有報(bào)道，李穎、李慶典通過桑葚多糖對羥基自由基和超氧負(fù)離子自由基的清除作用，評價(jià)桑葚多糖的抗氧化活性，表明桑葚多糖能夠清除自由基，阻斷自由基反應(yīng)鏈，具有一定的抗氧化及防衰老作用［2］。廖森泰等通過對糖尿病小鼠進(jìn)行降血糖治療試驗(yàn)，顯示桑葚多糖有顯著的降血糖作用［3］。但關(guān)于桑葚多糖的提取分離工藝報(bào)道較少，多采用大孔吸附樹脂提取純化桑葚多糖［4］，其工藝復(fù)雜，耗時(shí)較長，不利于工業(yè)生產(chǎn)。近年來，酶法作為一種提取生物活性成分的新技術(shù)的報(bào)道日益增多［5－6］，其方法高效簡單。本實(shí)驗(yàn)采用纖維素酶解法提取桑葚多糖，旨在篩選纖維素酶法提取桑葚中多糖的工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平FA1104(上海天平儀器廠)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海及精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、植物粉碎機(jī)FZ102(上海銳豐儀器儀表有限公司)、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、電熱式恒溫水浴鍋HHS－21－4(江蘇金壇宏凱儀器廠)、SHB－III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、80－2離心沉淀器(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)、722N可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

纖維素酶(活力40 000 U/g)(天津利華酶制劑有限公司)、桑葚(購自廣西百色市右江區(qū))、葡萄糖對照品(廣東汕頭市西隴化工廠)、其他所用試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果分析

2.1 桑葚多糖的提取［7］

纖維素酶懸浮液的制備:精密稱取纖維素酶1.25 g，用蒸餾水定容至500 mL放入冰箱待用，用前搖勻。

酶法提取:取1.0 g桑葚加緩沖溶液及不同體積的酶懸浮液，緩沖液及酶懸浮液的總體積為50 mL，于不同溫度在水浴振蕩器中反應(yīng)一定時(shí)間，沸水浴中滅活5.0 min，過濾，離心。

2.2 桑葚多糖的測定

本實(shí)驗(yàn)對多糖的測定采用硫酸—苯酚法［5］。取待測液1 mL置于10 mL的試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL的濃硫酸，搖勻，40℃水浴中反應(yīng)30 min，然后置于冷水中冷卻10 min，以葡萄糖為標(biāo)樣，于波長490 nm處測定吸光度值。由一元線性回歸方程推算出桑葚多糖的質(zhì)量。桑葚多糖的提取率即為樣品中桑葚多糖的質(zhì)量與樣品干燥粉末質(zhì)量的百分比。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥(105℃)至恒重的葡萄糖2.5 mg，加蒸餾水定容至50 mL，得標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，定容至50 mL，得不同濃度的稀釋液。分別精密吸取上述稀釋液1 mL按“2.2”中方法顯色，測定吸光度值，以吸光度(A)對質(zhì)量濃度C(mg/mL)進(jìn)行回歸，得回歸方程。由標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)計(jì)算出一元線性回歸方程為:Y=0.1069X－0.0057(其中Y指的是葡萄糖的含量，X表示吸光度)，r=0.9998，表明對照品葡萄糖含量在0.010～0.050 mg/mL范圍內(nèi)與對應(yīng)吸光度值有良好線性關(guān)系。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于酶解溫度、酶用量、酶解時(shí)間和pH對纖維素酶酶解影響較大，所以對纖維素酶提取桑葚多糖這4個因素進(jìn)行研究，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果和對簡化提取工藝的考慮，確定pH值為蒸餾水的自然值。最終篩選對桑葚多糖提取率影響最大的三個因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，即酶用量(A)，酶解溫度(B)和酶解時(shí)間(C)。提取液用0.2 mol/mL磷酸氫二鈉與0.1 mol/mL檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，對提取效果的影響以提取液中多糖含量為指標(biāo)(總多糖的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示)。

(1)酶用量的影響。精密稱取桑椹粉1.0 g 5份，分別按加酶量1、2、3、4、5 mL 加入纖維素酶懸浮液，在40℃下酶解提取120 min。測定桑椹多糖含量。結(jié)果見表1。

表1 加酶量對多糖得率的影響

在1～5 mL范圍內(nèi)，隨著加酶量的增加，多糖得率先上升后下降，最大值出現(xiàn)在3 mL處。其后多糖得率呈下降趨勢，這可能是桑椹多糖已基本提取完全，其它雜質(zhì)進(jìn)入提取液，使提取液粘度升高，擴(kuò)散速度變慢，導(dǎo)致多糖不易溶出。

(2)酶解溫度的影響。精密稱取桑椹粉1.0 g 5份，按加酶量3 mL加入纖維素酶懸浮液，分別在溫度30、35、40、45、50 ℃下酶解提取提取120 min。測定桑椹多糖含量。結(jié)果見表2。

表2 酶解溫度對多糖得率的影響

酶解溫度的影響可能包括兩個方面，一是溫度的增高可以加大多糖在提取液里的溶解度，二是酶解溫度會顯著影響纖維素酶的活性，表2表明，在30℃～55℃隨著溫度的升高，多糖得率總體呈先上升后下降趨勢，在40℃達(dá)最大值，這時(shí)的酶解溫度最適纖維素酶活性的發(fā)揮，隨著溫度的升高雖然增大了多糖在提取液中的溶解度，但纖維素酶活性的降低，可能導(dǎo)致多糖得率下降。

(3)酶解時(shí)間的影響。精密稱取桑椹粉1.0 g 5份，按加酶量3 mL加入纖維素酶懸浮液，在40℃下，分別酶解提取 90、120、150、180、210 min。測定桑椹多糖含量。結(jié)果見表3。

表3 酶解時(shí)間對多糖得率的影響

從表3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，多糖得率呈上升趨勢，在150 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，之后多糖得率趨于平緩下降，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，加大了酶在多糖提取中的反應(yīng)時(shí)間，使反應(yīng)充分進(jìn)行，直至多糖提取完全。但同時(shí)也加大了雜質(zhì)在提取液中的溶解量，故時(shí)間過長多糖得率會有所降低。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以酶用量(A)，酶解溫度(B)和酶解時(shí)間(C)為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個因素選取三個不同的水平。因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗(yàn)因素與水平

表5 纖維素酶輔助提取桑葚多糖條件的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析表

正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果(表3、表4)顯示，各因素對酶法提取桑葚多糖的影響大小順序?yàn)锽＞C＞A，即酶解溫度的影響最大，酶用量的影響最小，從省時(shí)的角度考慮，確定桑葚多糖酶輔助提取的最優(yōu)條件為A3B3C2。即加酶量4.0 mL，反應(yīng)溫度45℃，酶解時(shí)間150 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取桑椹3份，每份1.0 g，按優(yōu)選出的工藝進(jìn)行提取，即按4.0 mL加酶量，在45℃下進(jìn)行酶解提取150 min。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

從上表中可知此提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

大多數(shù)中藥材的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi);而纖維素是由β－D－葡萄糖以1，4－β－葡萄糖苷鍵連接，纖維素酶酶解可以促進(jìn)β－D－葡萄糖苷鍵的裂解，使植物細(xì)胞壁被破壞，有利于植物有效成分的浸出，還能促進(jìn)殘留半乳甘露聚糖主鏈(1，4－β－葡萄糖苷鍵連接)的降解，降低提取液的粘度，而提高桑葚多糖的提取率。

桑葚多糖多種多樣的生物活性以及在功能食品和臨床上的廣泛使用，使多糖生物資源成為天然藥物、生物化學(xué)及生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)［4］。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化桑葚多糖的酶解提取工藝，用蒸餾水為提取劑，以桑葚多糖得率為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法，得出最佳酶解提取工藝為:加酶量4.0 mL，反應(yīng)溫度45℃，酶解時(shí)間150 min。在此條件下，桑葚多糖的最佳提取率為14.77%。高于浸提法的提取率，并縮短了提取時(shí)間，降低了提取溫度。

本實(shí)驗(yàn)采用以蒸餾水為提取劑進(jìn)行提取，提取效率高，極大地縮短了提取周期，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的方法，起到簡化工藝流程，節(jié)省成本，減少雜質(zhì)的作用，具有合理、經(jīng)濟(jì)、可行的優(yōu)點(diǎn)，為多糖的提取方法及其工業(yè)化生產(chǎn)提供了新手段。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:281.

［2］李 穎，李慶典.桑葚多糖抗氧化作用的研究［J］.中國釀造，2010(4):59－61.

［3］廖森泰，鄒宇曉，鄭祥明，等.桑寧茶多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2004(3):327－329.

［4］惠賢民.大孔吸附樹脂純化桑葚多糖的工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6):2572－2573.

［5］傅國強(qiáng)，謝明勇，周 鵬，等.纖維素酶法提取茶多糖［J］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(4):362—366.

［6］邢秀芳，馬桔云，于宏芬，等.纖維素酶在葛根總黃酮提取中的應(yīng)用［J］.中草藥，2001，32(1):37—38.

［7］邱丹萍，鄒永芳，黃鎖義，等.白茅根多糖提取方法的比較研究［J］.中國釀造，2010(1):108－110.