王慶 楊華 金瑞良 胡忠義 劉忠華

Mtb是引起結(jié)核病的病原菌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球結(jié)核病發(fā)病率以每年1%的比率上升，約每年新增患者880萬(wàn)［1］，其中痰涂片陽(yáng)性的患者不到總數(shù)的1/2?！?000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告》［2］顯示，我國(guó)現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者451萬(wàn)，菌陽(yáng)肺結(jié)核患者僅為196萬(wàn)。因此，活動(dòng)性肺結(jié)核在常規(guī)檢測(cè)（培養(yǎng)和涂片）中檢出率過(guò)低是直接導(dǎo)致結(jié)核病在我國(guó)和全球廣泛流行的根本原因。血清學(xué)診斷作為對(duì)結(jié)核病菌陽(yáng)及菌陰患者均有效的檢測(cè)手段，一直是結(jié)核病診斷的研究熱點(diǎn)。

近期國(guó)外報(bào)道，Mtb基因缺失區(qū)域4（RD4）中蛋白R(shí)v0222用于血清學(xué)診斷具有較高的敏感度，同時(shí)在卡介苗接種者和非結(jié)核病患者中有較好的特異度，尤其對(duì)免疫缺陷患者較為敏感［3］。本研究構(gòu)建了重組蛋白R(shí)v0222，探討其用于結(jié)核病血清學(xué)診斷的可行性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料和方法

一、材料

1.菌種和載體：Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株，大腸埃希菌DH5α；BL21（DE3）和p ET30a載體（上海市肺科醫(yī)院保存），p MD18－T載體（購(gòu)自大連寶生物工程有限公司）。

2.工具酶和試劑：限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Tap聚合酶、異丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、純化試劑盒（購(gòu)自大連寶生物工程有限公司），組氨酸標(biāo)簽（His－tag）純化試劑盒（購(gòu)自美國(guó) Novagen公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白G（HRP－IgG）（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司），引物合成和測(cè)序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

3.檢測(cè)血清樣本：（1）實(shí)驗(yàn)對(duì)照血清：2份陰性對(duì)照血清為上海市肺科醫(yī)院門(mén)診正常體檢確認(rèn)的健康人血清，2份陽(yáng)性對(duì)照血清來(lái)自該院結(jié)核科確診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者。（2）142份待檢血清：82份按《結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)》［4］（主要指標(biāo)為持續(xù)2周以上低熱、咳嗽；食欲減退、消瘦；X線胸片異常鈣化點(diǎn)；痰涂片或Mtb培養(yǎng)陽(yáng)性及抗結(jié)核診斷3個(gè)月后癥狀明顯減輕者）確診為活動(dòng)性肺結(jié)核患者，其中涂片陽(yáng)性患者為40例，占48.8%；28份非結(jié)核肺部疾病患者包括8例肺癌（根據(jù)《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》［5］確診）、15例肺炎和5例肺氣腫患者（肺炎和肺氣腫根據(jù)《社區(qū)獲得性肺炎診斷與治療指南（草案）》［6］確診，肺炎患者主要為肺炎鏈球菌感染者）；32份健康體檢者血清。非結(jié)核肺部疾病患者的選取主要因?yàn)榇祟悓?duì)照有較為明顯的交叉反應(yīng)，以上血清均來(lái)自上海市肺科醫(yī)院。

二、方法

1.基因克隆和鑒定：以H37Rv染色體DNA為模板擴(kuò)增Rv0222基因片段。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1.5 min，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒處理后，鏈接到p MD18－T載體中；通過(guò)鏈接后p MD18－T酶切處理后，再亞克隆到表達(dá)載體p ET30a，構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET30a－Rv0222，挑選重組克隆送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

2.重組蛋白純化和復(fù)性：挑重組菌于含50μg/ml卡那霉素50 ml的LB肉湯培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱“LB培養(yǎng)基”）中過(guò)夜培養(yǎng)（18 h以上），以1∶100體積接種到1 L含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，37℃培養(yǎng)4～6 h，集菌后溶于60 ml緩沖液A（含8 mol尿素，10 mmol咪唑，p H 8.0）中重懸超聲破菌（功率400 W，超聲破菌5 s，靜止5 s，連續(xù)進(jìn)行30 min），18 110×g離心10 min后；經(jīng)漂洗緩沖液B（8 mol尿素，20 mmol咪唑，p H 8.0）漂洗；洗脫緩沖液C（8 mol尿素，250 mmol咪唑，p H 8.0）洗脫目的蛋白（重組蛋白），通過(guò)鎳柱純化流速＜3 ml/min。純化后重組蛋白放入半透膜中，在4℃的環(huán)境下，置于磷酸緩沖液（PBS）中4 h或過(guò)夜緩慢多次透析，透析后取樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。各步均留樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

3.重組蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定：純化蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后全濕轉(zhuǎn)?。?50 m A，45 min）。將轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜用含5%小牛血清的PBS封閉1 h后，用1∶200含5%小牛血清的PBS稀釋的結(jié)核病患者血清反應(yīng)1 h，使用0.1%吐溫80的PBS充分洗滌（PBST，即PBS加入吐溫）后，與1∶10 000含5%小牛血清的PBST稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP）－IgG溶液反應(yīng)2 h，再次PBST洗滌后加入四甲基聯(lián)本胺（TMB）底物及雙氧水反應(yīng)顯色。

4.重組蛋白檢測(cè)血清樣本：根據(jù)棋盤(pán)滴定法選擇最佳的包被濃度、血清稀釋度（1∶200）和HRPIgG稀釋度。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定Rv0222蛋白濃度，包被Rv0222蛋白抗原濃度為100 ng/ml，每孔100μl包板，4℃過(guò)夜，用PBST洗滌后，用含1%牛血清白蛋白封閉1 h，加100μl（1∶200）PBS稀釋的血清樣品，37℃溫育1 h，PBST洗滌，加1∶20 000稀釋的 HRP－IgG溶液，37℃溫育1 h，加TMB室溫顯色10 min，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀（型號(hào)mk3，美國(guó)熱電公司生產(chǎn)）波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)吸光度（A）值。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照，所有樣本均檢測(cè)2遍，不一致樣本需再次重復(fù)2遍，穩(wěn)定后方可入組統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)時(shí)對(duì)照樣品均設(shè)復(fù)孔。

5.統(tǒng)計(jì)方法：以健康對(duì)照組血清樣本A值的均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差（±2s）作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用MedCalc 11.5.0軟件對(duì)結(jié)核病患者、非結(jié)核病患者和健康對(duì)照者進(jìn)行完全隨機(jī)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、重組蛋白R(shí)v0222的構(gòu)建和純化

以Mtb參考株H37Rv為模板擴(kuò)增Rv0222基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET30a－Rv0222，測(cè)序后與H37Rv比對(duì)顯示：重組蛋白R(shí)v0222編碼基因與H37Rv上基因99.9%一致。對(duì)重組菌誘導(dǎo)后，經(jīng)超聲破菌溶解后流過(guò)His－tag柱，得到純度超過(guò)95%以上的重組蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000（圖1），圖中條帶4即為表達(dá)蛋白，雖然表達(dá)量不高，但為通過(guò)構(gòu)建的6個(gè)連續(xù)的組氨酸標(biāo)簽獲得的高純度重組蛋白（條帶6），表達(dá)重組蛋白主要以難溶的包涵體形式存在于離心沉淀中（條帶3和4）。

圖1 重組蛋白R(shí)v0222誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS－PAGE分析

二、重組蛋白的免疫印跡分析

純化重組蛋白轉(zhuǎn)膜后與結(jié)核病患者和健康體檢者血清作用，與結(jié)核病患者血清反應(yīng)后可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約27 000處被相應(yīng)抗體所捕獲，而健康體檢者相應(yīng)位置卻未見(jiàn)條帶，顯示重組抗原與結(jié)核病患者的血清抗體具有特異的免疫反應(yīng)性（圖2）。

圖2 純化蛋白R(shí)v0222的免疫印跡Western－blot分析

三、重組蛋白的血清學(xué)檢測(cè)

重組蛋白在驗(yàn)證其免疫反應(yīng)性后，檢測(cè)142份血清樣本（其中結(jié)核病患者82例，非結(jié)核病患者28例，健康體檢者32例），經(jīng)醫(yī)學(xué)分析軟件 Med Calc 11.5.0處理，ROC曲線下面積為0.893，最佳陽(yáng)性判定值為0.12時(shí)（健康人群平均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）（95%CI＝0.1085～0.1265，Z＝14.87，P＜0.0001），結(jié)核病患者檢測(cè)敏感度為69.5%（57/82），檢測(cè)非結(jié)核病患者（24例檢出陰性）和健康體檢者（30例檢出陰性）的特異度為90.0%［（24＋30）/60］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝25.78，P＜0.0001），樣本分布見(jiàn)圖3。結(jié)核病患者中Mtb涂片陽(yáng)性者為40例，抗體檢測(cè)陽(yáng)性者為31例，敏感度為77.5%（31/40）；結(jié)核病患者涂片陰性患者42例，抗體檢出26例，敏感度為61.9%（26/42），顯示Rv0222蛋白對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷有意義（χ2＝34.8，P＜0.0001）。

圖3 重組蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)各種血清樣本吸光度值（A 450）結(jié)果

討 論

Rv0222屬于Mtb基因RD4上的編碼基因，可能為Mtb的水合酶。RD4區(qū)是1999年Behr等［7］比較Mtb和卡介苗基因組后發(fā)現(xiàn)的16個(gè)缺失區(qū)之一，可能在卡介苗1927—1931年傳代的過(guò)程中丟失。RD區(qū)被很多學(xué)者認(rèn)為與Mtb的毒力直接相關(guān)［8－9］，是導(dǎo)致卡介苗毒力減弱的主要原因，因此RD區(qū)成為尋找結(jié)核病免疫學(xué)診斷抗原的方向之一。研究發(fā)現(xiàn)Rv0222基因在多達(dá)13種卡介苗亞株中缺失［10］，包括我國(guó)正在使用的巴斯德和丹麥株，這種缺失性理論上避免了卡介苗接種者可能產(chǎn)生的交叉反應(yīng)，對(duì)我國(guó)排除卡介苗接種者的假陽(yáng)性檢測(cè)較為有利。作為一種新的特異性抗原，Rv0222蛋白是Rosenkrands等［3］通過(guò)對(duì)RD區(qū)上47個(gè)編碼基因篩選后發(fā)現(xiàn)的，初步血清學(xué)評(píng)價(jià)顯示：其與38kD、16kD、A60等［11－14］公認(rèn)的診斷抗原在血清學(xué)診斷方面具有相似的檢出敏感度，同時(shí)對(duì)HIV陰性和HIV陽(yáng)性的結(jié)核病患者檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其抗體檢出保持一致，相對(duì)于部分Mtb抗原，因HIV陽(yáng)性患者免疫功能低下而無(wú)法檢出時(shí)，Rv0222卻影響較小。

本研究以p ET30a為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組蛋白R(shí)v0222，雖然重組菌中目的蛋白的表達(dá)量不高，但通過(guò)融合在Rv0222蛋白C端的連續(xù)6個(gè)組氨酸（His）標(biāo)簽，成功純化出高純度的目的蛋白（圖1）。重組蛋白 Western－blot分析發(fā)現(xiàn)，其與結(jié)核病患者的血清抗體發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白R(shí)v0222具有特異的免疫反應(yīng)性，可用于檢測(cè)結(jié)核病患者的相應(yīng)抗體。

以Rv0222作為診斷抗原檢測(cè)結(jié)核病患者血清，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，僅Rosenkrands等［3］對(duì)其血清學(xué)診斷做了小樣本的驗(yàn)證評(píng)價(jià)。本研究建立了Rv0222蛋白檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法，連續(xù)隨機(jī)選擇了142份血清樣本進(jìn)行初步評(píng)估，檢測(cè)結(jié)核病患者的敏感度為69.5%（57/82），非結(jié)核病患者和健康體檢者的特異度為90.0%（54/60），結(jié)果顯示結(jié)核病患者與對(duì)照者（非結(jié)核病患者和健康體檢者）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），其中對(duì)菌陰肺結(jié)核患者診斷敏感度為61.9%（26/42），結(jié)果較為理想。

研究中也存在幾點(diǎn)不足：（1）雖然有臨床診斷及涂片、培養(yǎng)作為對(duì)照，但未設(shè)置與其他蛋白的平行對(duì)照，未能反映出與38 000、16 000等優(yōu)勢(shì)抗原的優(yōu)劣；（2）所檢測(cè)結(jié)核病患者中菌陽(yáng)比例較高，也直接導(dǎo)致了敏感度較高；（3）特異性方面，對(duì)照樣本中非結(jié)核病患者數(shù)量不多，而疾病對(duì)照的特異度僅為85.7%（24/28），如果對(duì)照中疾病患者比例增多，那總的特異度會(huì)進(jìn)一步降低。針對(duì)以上問(wèn)題，大樣本、多種類的協(xié)同作用檢測(cè)抗體，在后續(xù)的研究中會(huì)重點(diǎn)考慮。

綜上，成功構(gòu)建重組蛋白R(shí)v0222工程菌，初步評(píng)估其抗體診斷的價(jià)值，雖然結(jié)果并不全面，但仍有一定的參考價(jià)值，Rv0222蛋白所具有的免疫反應(yīng)性有可能成為診斷和預(yù)防結(jié)核病的候選抗原之一。

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