孫國慶，哈 福，苗永旺，李大林

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225）

溶菌酶全稱為1，4－O－溶菌酶，又稱N－乙?；谒崴饷福且环N堿性水解酶，存在于微生物和多種動(dòng)、植物的組織及體液中。它可以裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 N－乙酰胞壁酸和 N－乙酰葡糖胺之間的β－（1，4）－糖苷鍵，具有抗菌、抗腫瘤、抑制血管生成等活性。堿和氧化劑對(duì)其有抑制作用，食鹽則對(duì)其有活化作用。

奶牛乳房炎是奶牛業(yè)中危害大、可導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的常見疾病之一，目前此種疾病已成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。全世界約有2.2億多頭奶牛，其中10%～30%患有各種類型的乳房炎，中國奶牛乳房炎發(fā)病率普遍高于國外。近幾十年來，由于濫用抗生素，菌株耐藥性越來越強(qiáng)，傳統(tǒng)的乳房炎抗生素療法的弊端已日益明顯，由此乳房炎抗性基因的研究逐漸成為熱點(diǎn)，溶菌酶基因就是其中的重要候選基因之一。

1 溶菌酶的發(fā)現(xiàn)及分類

1921年，Alexander Fleming（1881～1955）發(fā)現(xiàn)了一種驚人的溶菌物質(zhì)，后來稱之為溶菌酶（lysozyme，LYZ）。由于當(dāng)時(shí)人們未發(fā)現(xiàn)其對(duì)許多人類致病菌并有殺菌作用，所以一開始并未被重視。90多年后的今天，溶菌酶不僅作為一種模式系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、晶體學(xué)和分子生物學(xué)，而且其溶菌功能已為世人普遍接受并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和藥物制劑。溶菌酶生物學(xué)功能的很多方面還沒完全搞清楚，比如溶解肽聚糖所得的片段在細(xì)菌－宿主相互作用中發(fā)揮的作用、存在于同一宿主中的各種溶菌酶之間的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性等［1］。

1937年，Abraham與Robinson從卵蛋白中最先分離出溶菌酶晶體，此后人們?cè)谌撕蛣?dòng)物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。1984年，Jolles等在蛋白質(zhì)水平上對(duì)不同來源的人溶菌酶（human LYZ，hLYZ）進(jìn)行了研究，并率先發(fā)表了hLYZ氨基酸序列。1988年Castanon等從人組織細(xì)胞系（U－937）和胎盤文庫中篩選出hLYZ cDNA，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的描述。同年，Yoshimura等用免疫學(xué)方法從胎盤λgt11文庫中篩選到hLYZ cDNA，并在酵母中表達(dá)成功。然后，Chung等和Huang等分別從人的巨噬細(xì)胞、帕內(nèi)特細(xì)胞和中國人胎盤中克隆出hLYZ cDNA［2］。2001年，Strausberg等直接向GenBank提交了從人結(jié)腸腺瘤中克隆的hLYZ cDNA。

溶菌酶按其來源與氨基酸序列的差異可分為6類：c型（chicken or conventional type，雞蛋清）溶菌酶，包括來自于胃的溶菌酶和結(jié)合鈣離子的溶菌酶；g型（goose－type，鵝）溶菌酶；細(xì)菌溶菌酶；i型（in－vertebrate type，無脊椎動(dòng)物）溶菌酶；植物溶菌酶和噬菌體溶菌酶。目前，動(dòng)物界中發(fā)現(xiàn)三類溶菌酶，即c型、g型和i型。i型溶菌酶是溶菌酶家族的一個(gè)較新的成員，最初在海星（Asterias rubens）中發(fā)現(xiàn)，近年來被廣泛研究。對(duì)各類溶菌酶的系統(tǒng)發(fā)育分析得出，c型溶菌酶主要存在于脊索動(dòng)物門，節(jié)肢動(dòng)物門的一些綱中也以c型溶菌酶為主，在一些脊索動(dòng)物和雙殼貝類軟體動(dòng)物（無脊椎動(dòng)物）中發(fā)現(xiàn)了g型溶菌酶（至少是與其相關(guān)的基因）的存在。

一般來說，較高等的動(dòng)物都有i型溶菌酶的產(chǎn)生。雞蛋清溶菌酶是唯一同時(shí)存在于脊椎動(dòng)物、原索動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中的類型，也是目前研究得最廣泛、最透徹的類型。盡管這三類溶菌酶典型的一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性并不高，但是它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)卻有著驚人的相似。溶菌酶在抗菌防御方面的生物功能已普遍被人們所接受，此外，有些溶菌酶（不止在一類溶菌酶中）還可發(fā)揮消化酶的作用［1］。

牛LYZ基因主要在乳腺中表達(dá)，特別是在奶?；既榉垦椎臅r(shí)期，LYZ基因的表達(dá)量明顯增加，這可能是生物自身的一種防御機(jī)制。溶菌酶能夠水解微生物細(xì)胞壁的N－乙酰葡萄糖胺（NAG）和N－乙酰胞壁質(zhì)酸（NAM）間的β－1，4糖苷鍵，肽聚糖的空間結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞壁破裂。溶菌酶不但對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌具有直接的溶菌作用，而且還在相應(yīng)輔助因子（分泌型免疫球蛋白A和補(bǔ)體）的參與下，對(duì)革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）和真菌具有間接的溶解作用。另外，溶菌酶還能與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合使其滅活，并能夠增強(qiáng)抗菌素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的。

2 溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化

1965年，Phillips等人用x射線晶體結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)，確認(rèn)溶菌酶分子近橢圓形，大小為4.5nm×3.0nm×3.0nm，α螺旋僅占25%，在分子的一些區(qū)域有伸展著的β片層結(jié)構(gòu)。溶菌酶內(nèi)部幾乎均為非極性，疏水作用在溶菌酶的折疊構(gòu)象中起到重要作用，分子表面有一個(gè)容納多糖底物的裂隙，是溶菌酶的活性部位。

不同物種LYZ基因都由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。外顯子2編碼酶催化中心的殘基（Glu－35和Asp－52）；外顯子3編碼連接外顯子2區(qū)域的框架，確定底物位置，完善活性位點(diǎn)，提高催化效率；外顯子1和4編碼溶菌酶前體信號(hào)肽及N端和C端［3］。最先被測(cè)序的哺乳動(dòng)物溶菌酶基因是人類溶菌酶基因，該基因位于人類第12條染色體上，總長5 856bp，內(nèi)含子和第4外顯子中都存在重復(fù)序列，與雞溶菌酶基因的主要差別集中在內(nèi)含子和3＇非編碼區(qū)［4］。牛的LYZ基因位于5號(hào)染色體，全長5 673bp，5′－UTR長度為31bp，3′－UTR長度為489 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)核苷酸序列全長為444bp，編碼148個(gè)氨基酸；四個(gè)外顯子對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)大小分別為136bp、165bp、76bp和67bp［5］。1979年Baldacci等用分子克隆的方法獲得雞溶菌酶基因，全長約3.9kb，是其mRNA長度的6倍。在牛中最先發(fā)現(xiàn)了多基因編碼溶菌酶的現(xiàn)象，從此反芻動(dòng)物溶菌酶及其基因作為一種重要的模式系統(tǒng)在DNA復(fù)制、基因重組、遺傳進(jìn)化等研究領(lǐng)域被廣泛關(guān)注［6］。

C型溶菌酶可分為鈣結(jié)合溶菌酶和非鈣結(jié)合溶菌酶兩類。非鈣結(jié)合溶菌酶在一些鳥類和哺乳類中有發(fā)現(xiàn)，進(jìn)化上與α乳清蛋白關(guān)系較近，兩者氨基酸序列相似性約有40%，都擁有保守的二硫鍵和一段相似的內(nèi)含子－外顯子結(jié)構(gòu)，它們的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)也都相同。但表達(dá)部位和功能差別顯著。

與廣泛存在于動(dòng)物各種體液中的溶菌酶相比，α乳清蛋白只存在于哺乳動(dòng)物的乳汁和初乳中。另外，α乳清蛋白也沒有催化活性，但是它能改變半乳糖轉(zhuǎn)移酶的特異性，其與半乳糖轉(zhuǎn)移酶的相互作用可以促進(jìn)乳糖合成。有人認(rèn)為，哺乳動(dòng)物中溶菌酶和α乳清蛋白共存的進(jìn)化因素是共同祖先基因的重復(fù)突變及隨后的遺傳分化［7］。一般來說，α乳清蛋白不具備溶菌酶的活性，溶菌酶也不參與乳糖的合成，但是已有人在針鼴乳中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白，它同時(shí)具備了α乳清蛋白（很弱）和溶菌酶的特性［8］。這一發(fā)現(xiàn)有力地支持了溶菌酶和α乳清蛋白來自于同一祖先的假設(shè)。

溶菌酶在動(dòng)物界普遍存在，不同溶菌酶也可同時(shí)發(fā)現(xiàn)于某一類物種中（例如，脊椎動(dòng)物中的c型和g型溶菌酶，節(jié)肢動(dòng)物中的c型和i型溶菌酶，軟體動(dòng)物中的g型和i型溶菌酶），由此事實(shí)可自然聯(lián)想到三種溶菌酶的進(jìn)化關(guān)系。不同類型的動(dòng)物溶菌酶在結(jié)構(gòu)上的一致性也揭示它們有可能來自于同一前體，但是其氨基酸序列的巨大差異又使這一猜測(cè)充滿了不確定性［1］。

3 溶菌酶基因的多態(tài)性研究

陳仁金等利用PCR－SSCP技術(shù)對(duì)30個(gè)公牛家系的610頭中國荷斯坦牛LYZ基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，利用最小二乘均數(shù)法對(duì)LYZ基因的多態(tài)位點(diǎn)與體細(xì)胞評(píng)分（somatic cell score，SCS）和305d產(chǎn)奶量進(jìn)行相關(guān)分析［9］。根據(jù)PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的牛的LYZ基因（GenBank登錄號(hào)：NC－007303）序列比對(duì)表明，在LYZ基因的外顯子1的115位點(diǎn)發(fā)生T＞G的核苷酸替換，此替換使編碼蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸由Arg變?yōu)長eu；該位點(diǎn)經(jīng)PCR－SSCP法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了3種基因型TT、TG和GG。研究表明，115T＞G位點(diǎn)的GG基因型對(duì)中國荷斯坦牛的SCS和305d產(chǎn)奶量有較大的遺傳效應(yīng)，可作為分子標(biāo)記用于奶牛乳房炎抗性的篩選［9］。Sahoo等通過對(duì)印度河流型水牛的研究發(fā)現(xiàn)，在LYZ基因外顯子3上存在多態(tài)位點(diǎn)，并闡明了其與LYZ活性和體細(xì)胞數(shù)（somatic cell count，SCC）的關(guān)聯(lián)性［10］。孫懷昌等人研究結(jié)果表明，表達(dá)人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒對(duì)奶牛乳房炎具有可靠、持久的治療效果，可以代替抗菌素使用［11］。

陳仁金等對(duì)牛亞科6個(gè)群體溶菌酶基因的編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)合GenBank上海福特牛該基因（GenBank登錄號(hào)：NC＿007303）編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行了遺傳和進(jìn)化分析。結(jié)果表明，在檢測(cè)的樣本中（水牛除外），有5個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，定義了9種單倍型；群內(nèi)核苷酸多樣性（Pi）在0.00000～0.00196之間，揭示群體內(nèi)遺傳多樣性較低。構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹表明，瘤牛、蒙古牛和魯西黃牛間關(guān)系密切，瘤牛和普通牛與牦牛關(guān)系相對(duì)較近，而與大額牛關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，為牛亞科的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了一定理論基礎(chǔ)［12］。李銳等用PCR的方法擴(kuò)增并測(cè)定了大額牛LYZ基因的編碼區(qū)核苷酸序列（444bp），其中 AT含量（53.95%）明顯高于GC含量（46.05%），并與GenBank上8個(gè)物種相應(yīng)基因編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)大額牛與普通牛（核苷酸序列一致性為99.3%）首先聚為一類，再與其他物種（與人、豬、家鼠、溝鼠、猊猴、雞和斑馬魚核苷酸序列一致性為76.6%、79.4%、81.8%、71.3%、68.2%、58.9% 和50.5%）聚為一類。該系統(tǒng)聚類結(jié)果與動(dòng)物學(xué)分類基本一致，亦與攀寶良利用乳蛋白基因構(gòu)建反芻動(dòng)物種系發(fā)生樹結(jié)果［13］基本一致，表明LYZ基因適合構(gòu)建不同物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹［14］。

侯其瑞等對(duì)京海黃雞的LYZ基因的SNPs與生長、產(chǎn)蛋性能和體重的關(guān)聯(lián)分析得出，LYZ基因可能是控制京海黃雞生長發(fā)育的主基因或與主基因緊密連鎖，暗示在選種、育種過程中，可將雞LYZ基因作為京海黃雞體重候選基因應(yīng)用于遺傳標(biāo)記輔助選擇［15－16］。許罕華等在編碼細(xì)菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶的融合基因序列中插入雞LYZ基因3＇端核基質(zhì)附著區(qū)（MAR）表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果表明，雞LYZ基因3＇端MAR在同源細(xì)胞系對(duì)基因表達(dá)沒有激活作用，與該基因5＇端MAR在同源或異源細(xì)胞系中能激活基因表達(dá)形成鮮明對(duì)照，表明5＇端MAR和3＇端 MAR在調(diào)節(jié)雞LYZ基因表達(dá)上存在一種協(xié)調(diào)關(guān)系。人溶菌酶突變可導(dǎo)致遺傳性非神經(jīng)系統(tǒng)淀粉樣病變癥（h ereditary systemic amylo idosis），由溶菌酶氨基酸序列中Phe57Ile、Trp64Arg、Ile56Thr和 Asp67His改變引起［17－18］，該病患者組織中有大量的淀粉樣物質(zhì)沉淀，臨床表現(xiàn)伴隨腎臟、心臟和肝臟的病變。

4 溶菌酶及其基因的應(yīng)用前景

溶菌酶具有多種藥理作用，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效。溶菌酶具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的功能，用溶菌酶處理G＋細(xì)菌可以在破壞細(xì)胞壁后得到原生質(zhì)體，所以被廣泛用于生物技術(shù)中，成為基因工程、細(xì)胞工程中細(xì)胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶作為一種非特異性免疫因子，對(duì)腸道中腐敗性微生物有特殊殺滅作用，溶菌酶是雙歧桿菌增長因子，有防止腸炎和變態(tài)反應(yīng)的作用，對(duì)嬰、幼兒的腸道菌群有平衡作用。有試驗(yàn)表明，在低度酒中每公斤添加20mg的溶菌酶替代水楊酸作防腐劑，對(duì)酒的風(fēng)味無不良影響，且受酒類澄清劑的影響很小，并可以去除水楊酸的毒性，是低度酒類較好的防腐劑。日本成功把溶菌酶用于清酒的防腐劑。最近的研究表明，水牛奶中的溶菌酶與歐洲牛（bovine）的有56.5%同源性，與馬的有30.4%同源性。水牛溶菌酶的特異活性是普通牛的10倍，并且具有更加廣的pH耐受范圍。該酶主要對(duì)革蘭氏陽性菌有效。據(jù)奶水牛產(chǎn)地當(dāng)?shù)厝朔Q，食用水牛奶不易生病，具有良好的增強(qiáng)免疫力功效。

雖然溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，但天然含量少，提取純化過程步驟繁瑣，產(chǎn)量低，無法大量獲取，若采用化學(xué)合成方法成本昂貴，大多數(shù)普通患者無法承受。與此相比，若采用基因工程的方法來合成溶菌酶，它具有操作簡單，成本比較廉價(jià)，能大量獲取，重復(fù)性好，有廣闊的市場應(yīng)用前景。牛乳溶菌酶作為c型溶菌酶中的一種，在治療奶牛子宮內(nèi)膜炎、乳房炎等細(xì)菌性疾病中不僅具有相似的生物學(xué)作用，還具有同源性的優(yōu)勢(shì)。付世新等通過畢赤酵母GS115分泌表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組牛乳溶菌酶，為溶菌酶的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)［19］。

對(duì)LYZ基因的研究多集中在轉(zhuǎn)基因和疾病防治上，而對(duì)牛的LYZ基因其在機(jī)體中的生物功能和作用途徑還有很多尚待探索的地方。而目前對(duì)牛的LYZ基因多態(tài)性與奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)分析的研究較少。劉梅等認(rèn)為未來的研究重點(diǎn)已經(jīng)不是溶菌酶的殺菌作用，而是其消化功能和其他未知的生物學(xué)功能［20］。研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物的皺胃、食葉鳥的嗉囊、文昌魚腸和一些昆蟲（如果蠅、工蟻、臭蟲和蚊子等）消化道的不同部位以及唾液腺中，溶菌酶c的含量豐富，推測(cè)可能與溶菌酶c的消化功能相適應(yīng)［20］。Lee－Huang等研究發(fā)現(xiàn)，人溶菌酶作為人絨毛膜促性腺激素的組分之一，其107～115位的9個(gè)氨基酸（RAWVAWRNR）能有效抑制HIV病毒的復(fù)制，并能調(diào)節(jié)HIV感染細(xì)胞的基因表達(dá)，具有抗HIV病毒的作用［21］。此外，在工業(yè)上，溶菌酶可以作為食品的保鮮劑或添加劑。例如，在嬰兒食品中添加溶菌酶可以使其更接近人乳的成分。同時(shí)，溶菌酶能夠增強(qiáng)抗生素的作用效力，增加機(jī)體的抗感染能力。隨著溶菌酶功能的不斷發(fā)現(xiàn)，在未來的工業(yè)、醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域中，溶菌酶必將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。已有人嘗試?yán)肔YZ基因來研究生物的進(jìn)化，并得到與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法、生化方法等基本一致的結(jié)果，表明LYZ基因可能對(duì)生物進(jìn)化研究有幫助。

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