吳小麗 閉蘭 趙亞杰 羅丹 齊建新 王炯 李忠明

近年來，結(jié)核病疫情嚴(yán)重，卡介苗雖然是全球使用最廣泛的預(yù)防結(jié)核病的疫苗，可預(yù)防和減輕兒童的重癥結(jié)核病，但對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)效果不穩(wěn)定［1］，因而，新型結(jié)核疫苗的研究對(duì)于預(yù)防和控制結(jié)核病具有重要意義。Mtb分泌蛋白Ag85復(fù)合物是Mtb的主要分泌性蛋白，也是Mtb主要保護(hù)性靶抗原的一部分，Ag85復(fù)合物在Mtb H37Rv株中占分泌蛋白總量的30%［2］，是一組主要的 Mtb分泌蛋白，具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶活性，在Mtb細(xì)胞壁合成的最后階段發(fā)揮重要作用。將Ag85蛋白或DNA疫苗免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)［3］，是新疫苗研制的熱點(diǎn)。為了研究本所中試生產(chǎn)的結(jié)核DNA疫苗的免疫效能，本實(shí)驗(yàn)將編碼Ag85A蛋白的質(zhì)粒免疫小鼠，對(duì)該疫苗的免疫效能進(jìn)行研究，茲報(bào)告如下。

材料和方法

一、材料

小鼠IFN－γELISA 檢測(cè)試劑盒和小鼠IL－4 ELISA檢測(cè)試劑盒，為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；小鼠IFN－γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試劑盒（ELISPOT），為Mabtech公司產(chǎn)品。

二、方法

1.動(dòng)物分組：選取4～6周齡BALB/c小鼠，通過數(shù)字表法隨機(jī)分成2組，每組10只，一組為結(jié)核DNA疫苗免疫組，一組為PBS對(duì)照組。

2.小鼠免疫：將我所300 L發(fā)酵罐中試規(guī)模生產(chǎn)的凍干結(jié)核DNA疫苗（結(jié)核DNA疫苗，批號(hào)090607）用滅菌生理鹽水復(fù)溶，配制成1 mg/ml溶液，以每次每只100μg/100μl的劑量采用兩點(diǎn)注射于小鼠后腿肌內(nèi)進(jìn)行免疫，共免疫3次，每次間隔3周。

3.樣本采集：（1）血清樣本采集：共采集2次血樣標(biāo)本，分別為免疫前眼眶采基礎(chǔ)血及免疫結(jié)束后第3周摘眼球取血。（2）脾細(xì)胞制備：摘眼球取血，隨后斷頸處死小鼠，通過無菌操作取出小鼠脾臟，采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）分離淋巴細(xì)胞，通過20%FBS－RPMI1640培養(yǎng)基（含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液）調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml。

4.小鼠脾細(xì)胞IFN－γ分泌檢測(cè)：采用Mabtech公司Mouse IFN－γELISPOT進(jìn)行檢測(cè)。（1）將調(diào)整好濃度（1×106個(gè)/ml）的細(xì)胞懸液加入各實(shí)驗(yàn)孔，每只小鼠12個(gè)孔，100μl/孔（4個(gè)孔一組，分別加入Ag85A、陰性對(duì)照、合成肽）；每塊板設(shè)置一組質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照（4個(gè)孔，各板之間應(yīng)選取同一只小鼠的淋巴細(xì)胞）、背景負(fù)對(duì)照（4個(gè)孔，加入20%FBSRPMI 1640培養(yǎng)基）。（2）分別加入刺激物Ag85A、20%FBS－RPMI 1640（不加刺激物）、合成肽（10μl/孔），質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照中加入刀豆蛋白A（Con A）刺激物（10μl/孔），背景負(fù)對(duì)照加入20%FBS－RPMI 1640。（3）所有樣品和刺激物加完后，蓋好板蓋。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。（4）具體檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行。（5）將ELISPOT板寄往達(dá)科為生物技術(shù)有限公司（深圳實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

5.脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置免疫組小鼠脾細(xì)胞和對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞。步驟如下：（1）將小鼠（1×106）個(gè)/ml脾細(xì)胞1 ml懸于100μl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，二組同時(shí)加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的兔抗鼠CD8抗體各10μl，室溫避光孵育30 min。（2）PBS洗細(xì)胞2次，加入2%甲醛固定液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6.血清細(xì)胞因子（IFN－γ、IL－4）檢測(cè)：（1）血清IFN－γ檢測(cè)：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IFN－γ酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。①?gòu)囊哑胶庵潦覝氐拿芊獯腥〕鏊璋鍡l，除空白孔外，分別將血清樣本（19只小鼠，每只重復(fù)2個(gè)孔，共38個(gè)孔）和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品 （100μl/孔）加入相應(yīng)孔中，37℃濕盒孵育90 min。②洗板5次，除空白孔外，加入生物素化抗體工作液 （100μl/孔），37℃濕盒孵育60 min。③洗板5次，除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液 （100μl/孔），37℃濕盒孵育30 min。④洗板5次，加入顯色劑100μl/孔，避光37℃濕盒孵育10～15 min。⑤加入終止液100μl/孔，混勻后5 min內(nèi)酶標(biāo)儀讀取450 nm和630 nm吸光度值（A450/630）。（2）血清IL－4檢測(cè)：采用北京四正柏生物科技有限公司小鼠IL－4酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行（方法和步驟同血清IFN－γ檢測(cè)）。

7.血清抗體檢測(cè)：采用間接ELISA方法對(duì)小鼠血清抗Ag85A抗體進(jìn)行檢測(cè)。（1）包被：用碳酸鹽緩沖液將Ag85A稀釋至10μg/ml，加入96孔微孔板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)）每孔100μl，放4℃濕盒過夜。（2）封閉：棄包被液，用含5/104吐溫－20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗板5遍，用紗布拍干。每孔加1%BSA 200μl，置37℃濕盒2 h。封閉好的96孔微孔板烘干后置4℃冰箱內(nèi)，1周內(nèi)使用。（3）加樣：將每只小鼠免疫前后采集的血清按確定的稀釋倍數(shù)1∶10稀釋（稀釋液為1%BSA）；100μl/孔，置于37℃濕盒，溫育60 min。（4）加酶結(jié)合物：PBST洗板5遍，用紗布拍干。用抗體稀釋液將辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗大鼠免疫球蛋白G（HRP－GAM IgG）稀釋至1∶20 000，加入96孔微孔板，每孔100μl，置于37℃濕盒，溫育30 min。（5）顯色：PBST洗板5遍，用紗布拍干。先加入底物A液顯色（成分是：NaAc·3H2O 9.185 g，檸檬酸1.576 g，過氧化脲0.45 g，加雙蒸水溶解后稀釋至750 ml，調(diào)p H值至5.0～5.5），每孔50μl，再加入底物B液顯色，每孔50μl，置37℃反應(yīng)10 min后，每孔加入2 mol/L硫酸50μl終止顯色。（6）讀數(shù)：終止反應(yīng)后30 min內(nèi)，酶標(biāo)閱讀儀測(cè)定A450和A630值，A450減去A630，以行校對(duì)。

8.數(shù)據(jù)分析：對(duì)于脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率和血清細(xì)胞因子IFN－γ、IL－4水平測(cè)定結(jié)果采用t檢驗(yàn)比較；脾細(xì)胞特異性IFN－γ分泌水平采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較兩組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞免疫相關(guān)因子檢測(cè)

1.小鼠脾細(xì)胞IFN－γ分泌檢測(cè)：根據(jù)讀板結(jié)果，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示：t＝36.538，P＝0.018，結(jié)核DNA疫苗免疫組分泌IFN－γ細(xì)胞個(gè)數(shù)（103.6±112.14）高于PBS對(duì)照組（5.78±5.83），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝36.538，P＝0.018）（表1）。

2.脾細(xì)胞CD4＋、CD8＋百分率檢測(cè)：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，結(jié)核DNA疫苗免疫組CD4＋細(xì)胞百分率均值為21.57%，高于PBS對(duì)照組12.17%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.043，P＝0.038）；結(jié)核DNA疫苗免疫組CD8＋細(xì)胞百分率均值（13.70%）和 PBS對(duì)照組（10.57%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.847，P＝0.445）。

3.血清細(xì)胞因子（IFN－γ、IL－4）檢測(cè)：（1）血清IFN－γ水平檢測(cè)：每只小鼠血樣設(shè)復(fù)孔，求其重復(fù)的兩孔均值（表2）。結(jié)核DNA疫苗免疫組IFN－γ水平 ［（129.6±159.0）pg/ml］高 于 PBS 對(duì) 照 組［（76.5±21.5）pg/ml］，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－1.047，P＝0.309）。（2）血清IL－4水平檢測(cè)：每只小鼠血樣設(shè)復(fù)孔，求其重復(fù)的兩孔均值（表3）。結(jié)核DNA 疫苗免疫組IL－4水平［（146.2±34.3）pg/ml］低于PBS對(duì)照組（177.7±28.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.244，P＝0.038）。（3）血清抗體檢測(cè)：將各組免疫前后血清中特異性抗Ag85A抗體通過ELISA檢測(cè)吸光度值，并用Excel軟件制圖（圖1），從圖中可以看出A 值均小于0.2，免疫前后、免疫組與對(duì)照組抗體水平從免疫學(xué)角度講均無免疫學(xué)意義。

表1 不同編號(hào)小鼠在兩組中采用讀板機(jī)對(duì)ELISPOT讀取的斑點(diǎn)數(shù)（個(gè)）

表2 PBS對(duì)照組和結(jié)核DNA疫苗免疫組IFN－γ水平的檢測(cè)結(jié)果（pg/ml）

表3 PBS對(duì)照組和結(jié)核DNA疫苗免疫組IL－4水平檢測(cè)結(jié)果（pg/ml）

圖1 小鼠血清特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

討 論

對(duì)于新型疫苗的評(píng)價(jià)，一般是從兩個(gè)方面進(jìn)行的［4－5］，一個(gè)是免疫學(xué)指標(biāo)的變化，包括抗體水平的變化，免疫細(xì)胞水平的變化等；另一個(gè)是流行病學(xué)指標(biāo)，即現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，包括新型疫苗對(duì)發(fā)病率、病死率的影響，發(fā)病后癥狀減輕的程度等。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)武漢生物制品研究所研制的結(jié)核核酸疫苗進(jìn)行初步效果評(píng)價(jià)，所以只觀察疫苗對(duì)正常動(dòng)物免疫學(xué)指標(biāo)的影響。機(jī)體的抗結(jié)核病免疫反應(yīng)是個(gè)非常復(fù)雜的過程，到目前為止對(duì)其確切機(jī)制仍然不甚明了［6］。因此，在疫苗評(píng)價(jià)時(shí)，缺乏公認(rèn)的免疫學(xué)指標(biāo)。但是，一般認(rèn)為，結(jié)核病免疫機(jī)制主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫［7］，包括CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的效應(yīng)，筆者采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核核酸疫苗對(duì)外周免疫器官（脾）T細(xì)胞亞群的影響。CD4＋Th1細(xì)胞介導(dǎo)的，以巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞免疫在抗結(jié)核免疫中處于中心地位［8－9］，CD4＋Th1通過釋放IFN－γ等細(xì)胞因子活化巨噬細(xì)胞進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)外的Mtb；雖然CD4＋Th2通過產(chǎn)生IL－4等細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生針對(duì)Mtb抗原的抗體，但是這些抗體在機(jī)體的抗結(jié)核免疫中無保護(hù)作用［10］。所以，筆者以動(dòng)物外周血和外周免疫器官（脾）中IFN－γ水平的變化間接監(jiān)測(cè)CD4＋T細(xì)胞是否向Th1分化，以外周血中IL－4水平變化間接監(jiān)測(cè)CD4＋T細(xì)胞是否向Th2分化，進(jìn)而明確疫苗免疫后動(dòng)物體免疫應(yīng)答的方向。從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果可以看到，結(jié)核DNA疫苗免疫組CD4＋細(xì)胞百分率高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），而CD8＋細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明結(jié)核DNA疫苗主要引起Th1細(xì)胞的效應(yīng)。誘導(dǎo)CD4＋Th1細(xì)胞反應(yīng)，可以加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)Mtb的殺傷作用，但進(jìn)一步驗(yàn)證需要在有資質(zhì)的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行豚鼠動(dòng)物模型攻毒實(shí)驗(yàn)。從ELISA檢測(cè)結(jié)果可知，在結(jié)核DNA疫苗免疫組免疫前后外周血抗Ag85A抗體水平?jīng)]有明顯變化。Ag85蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的T細(xì)胞增殖和刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的INF－γ［12］，用 Ag85免疫的小鼠能夠抵抗 Mtb的攻擊，在感染過Mtb的人的血清中也可以測(cè)到含量較高的Ag85的抗體［13］，但是，本實(shí)驗(yàn)從Ag85抗體的結(jié)果來看，沒有刺激產(chǎn)生抗體，可能是免疫程序和采血時(shí)間差異造成的；究竟多少劑量和怎樣的免疫程序能到達(dá)最好的效果，有待于在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步進(jìn)行摸索。

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