李志 達澤蛟 章國平 李瑞營 劉萬波 蘇娟 張穎 祝秉東

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由 Mtb引起的疾病，據(jù)2009年世界衛(wèi)生組織報道，每年約940萬例患者中180萬例死于此病。并且Mtb和HIV雙重感染的出現(xiàn)，使TB的防治更加困難。BCG作為惟一有效的TB疫苗［1］，雖然廣泛應(yīng)用于新生兒的TB防治，但是不能有效阻止成人肺結(jié)核的發(fā)生［2］；同時環(huán)境分枝桿菌、寄生蟲的感染都會影響B(tài)CG的效果［3－4］。因此，迫切需要發(fā)展更加有效的預(yù)防性和治療性的TB疫苗［5］。亞單位疫苗組成成分明確、使用安全［6］，不受環(huán)境分枝桿菌的影響［7］，能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。由于亞單位疫苗的免疫保護效果難以超過BCG［8］，采用BCG初始免疫－亞單位疫苗增強免疫的策略，可以提高成人的免疫效果［9－10］，同時符合我國新生兒預(yù)防接種BCG的國情。

結(jié)核病難以徹底治愈的重要原因是Mtb能以休眠狀態(tài)存在于宿主體內(nèi)，并保持持久活性［11］。復(fù)活促進因子（resuscitation－promoting factor，Rpf）最初在藤黃微球菌（M.luteus）中發(fā)現(xiàn)，該因子可以促進休眠菌的復(fù)蘇和生長。經(jīng)雜交試驗證實Rpf基因也存在于多種分枝桿菌中。Mtb含有5個Rpf樣基因：rpfA （Rv0867c）、rpfB （Rv1009）、rpfC （Rv1884c）、rpfD （Rv2389c）和rpfE （Rv2450c）［12］。有文獻報道Rpf蛋白引起的免疫應(yīng)答可有效抵抗Mtb的激活［13－14］，其中 Rpf E蛋白對 C57BL/6小鼠有免疫保護作用［15］；重組Rpf E蛋白對BCG休眠菌有促生長作用［16］。聯(lián)合不同時相表達的蛋白所制成的融合蛋白疫苗［17］，可用于TB的預(yù)防和治療。本實驗同時也選擇了 Mtb感染早期分泌性蛋白 ESAT 6［18－19］。ESAT6編碼基因位于RD1區(qū)，全長288 bp，BCG中缺乏，僅存在于有毒力的 Mtb中［20－21］。

材料和方法

一、材料

Mtb H37Rv株、臨床株由甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院提供；BCG菌株（丹麥株）由蘭州生物制品研究所惠贈；pET30a、E.Coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、重組 質(zhì) 粒 p ET30a－esat6、pET30a－rpfE、ESAT6 蛋白由本實驗室制備保存。各種限制性內(nèi)切酶、連接酶及DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；寡核苷酸引物的合成、重組質(zhì)粒的測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成；二甲基三十六烷基銨 （DDA）購自Sigma－Aldrich公司；弱陰離子交換柱IEX（DEAE）及 HIC（Octyl FF）F層析柱均購自GE healthcare公司；鼠IFN－γELISA檢測試劑盒、RPMI－1640培養(yǎng)基購自深圳達科為生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。C57BL/6小鼠（SPF級），雌性，6～8周齡，體重18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物室。

二、方法

1.Mtb基因組DNA的提?。喝∩倭颗R床Mtb接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3周。取適量培養(yǎng)物重懸于400μl的TE緩沖液中，80℃水浴40 min，殺滅菌株。加入10 mg/ml溶菌酶100μl，充分研磨后，37℃水浴過夜。加入70μl 10%SDS（十二烷基硫酸鈉），26μl 10 mg/ml蛋白酶K混勻，65℃孵育30 min，加入25 mg/ml RNA酶16μl，搖勻后室溫放置5 min。依次加入100μl 5 mol/L NaCl，100μl CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）/NaCl，65℃孵育10 min。用等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提，12 000×g離心5 min，將上清液移至干凈離心管。加一倍體積異丙醇顛倒混勻，沉淀DNA，70%乙醇漂洗后吹干，溶于40μl TE緩沖液，20℃保存。

2.目的基因的擴增：通過信號肽預(yù)測軟件預(yù)測rpfE 信 號 肽［22－23］，設(shè) 計 引 物。 上 游 引 物 P1（5′－CGGGAATTCATGGACGACGCGGGCTTGGA，下劃線為EcoR Ⅰ酶切位點）；下游引物P2（5′－ATA AAGCTTTCAGCCGCGGCGGCCGCAGA，下劃線為HindⅢ 酶切位點）。

PCR反應(yīng)體系：16.25μl水，5×buffer 5μl，d NTP（脫氧核糖核苷三磷酸）2μl，P1、P2（上下游引物）各0.5μl，DNA 模 板0.5μl，DNA 聚合酶0.25μl。PCR反應(yīng)條件：98℃變性15 s，63℃退火15 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化回收。

3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒p ET30a－esat6分別經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切后，在T4 DNA連接酶催化下，16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.Coli DH5α（實驗中常用的宿主菌）感受態(tài)細胞，隨機篩選陽性克隆接種于5 ml含卡那霉素（50μg/ml）的LB（luria－bertani）液體培養(yǎng)基，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。小量提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切、PCR鑒定后由北京六合華大基因科技股份有限公司進行基因測序。

4.融合蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析：將經(jīng)測序驗證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）（表達菌），篩選陽性單克隆接種于含卡那霉素（50μg/ml）的LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。按1∶200的接種量進行轉(zhuǎn)接，37℃振蕩培養(yǎng)3 h至 A600值為0.6～0.8，加IPTG（異丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷）至終濃度為0.5 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達4 h。收集菌體超聲裂菌，離心后將上清、沉淀分別制樣，通過12%SDSPAGE（SDS－聚丙烯酰胺凝膠）進行分析。

5.融合蛋白的純化：培養(yǎng)1000 ml菌液，IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白，8000×g離心15 min，收集細菌。細菌重懸于20 mmol PBS（磷酸鹽緩沖液）緩沖液（p H 7.4），冰浴下超聲破碎細菌1 h（180 W，超聲波處理1 s停1 s），8000×g離心20 min，收集包涵體。將包涵體溶于8 mol的尿素，溶解的蛋白依次用尿素梯度濃度（6、4、2、1、0.5、0 mol尿素＋5 mmol/L Tris－HCl（p H 8.0）4℃透析12 h。復(fù)性后的蛋白按照AKTA（蛋白純化系統(tǒng)）制備型液相色譜蛋白分析儀純化步驟進行純化，A液20 mmol PBS＋1 mol NaCl（p H 7.4）；B 液20 mmol PBS＋2 mol NaCl（p H 7.4）。先安裝弱陰離子交換柱IEX（DEAE）（一種純化柱型號），收集不同吸收峰下的洗脫液，12%SDS－PAGE檢測；將純度較高的目的蛋白富集后，再用疏水層析柱HIC（Octyl FF）（一種純化柱型號）進行純化，方法同上。SDS－PAGE分析收集目的蛋白，PBS透析過夜，考馬斯亮藍法（Bradford法）測定蛋白質(zhì)濃度。

6.蛋白Rpf E表達及純化：將帶有His標簽的重組質(zhì)粒p ET30a－rpfE轉(zhuǎn)化BL21，誘導(dǎo)表達方法同上。收集菌體重懸于PBS緩沖液（p H 7.4），冰浴下超聲破碎細菌30 min（180 W，超聲波處理1 s停1 s）。8000×g離心20 min，收集上清，親和層析法純化蛋白，純化步驟同上。A液20 mmol Na2HPO4＋0.5 mol NaCl＋20 mmol imidazole（咪 唑）（p H 7.4）；B 液20 mmol Na2HPO4＋0.5 mol NaCl＋500 mmol imidazole（p H 7.4）收集不同吸收峰下的洗脫液，SDS－PAGE檢測，富集目的蛋白，PBS透析后保存。

7.亞單位疫苗的配制及動物分組：亞單位疫苗選用了2種佐劑，進行了2次動物實驗。第一次實驗選用DDA為佐劑。DDA用PBS制成2.5 mg/ml，80℃水浴10 min促溶，冷卻至室溫后使用。蛋白用PBS稀釋至0.2 mg/ml。取100μl DDA溶液與等量蛋白充分乳化。實驗動物雌性C57BL/6小鼠共30只，完全隨機分為5組，分別為ESAT6、Rpf E、ESAT6－Rpf E、PBS、BCG組，每組6只。分別將蛋白ESAT6、Rpf E、ESAT6－RpfE 與佐劑 DDA 制備的蛋白疫苗，腹股溝皮下免疫小鼠（200μl/只）。免疫3次，每次間隔3周。PBS組注射PBS 200μl/只，BCG組接種BCG 5×106CFU/只。末次免疫8周后測定小鼠IFN－γ水平和血清特異性抗體IgG2b、IgG1。

第二次實驗選用DPG［DDA＋poly（I：C）＋明膠］為佐劑。蛋白用PBS稀釋至0.4 mg/ml，poly（I：C）用 PBS制成1 mg/ml，明膠用 PBS配制成16 mg/ml，于40℃水浴10 min，冷卻至室溫。DDA用PBS制成5 mg/ml，80℃水浴10 min促溶，冷卻至室溫后使用。取50μl蛋白與等量的poly（I：C）、DDA充分混勻后，緩慢加50μl明膠，充分乳化。將融合蛋白ESAT6－Rpf E與佐劑DPG［DDA＋poly（I：C）＋明膠］制備疫苗，免疫策略同上，同時設(shè)立PBS和BCG組對照。末次免疫8周后，采用酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）測定分泌表達IFN－γ的細胞數(shù)。

8.ELISA檢測免疫小鼠脾細胞分泌IFN－γ水平：末次免疫8周后處死小鼠，無菌分離脾臟，經(jīng)研磨、尼龍網(wǎng)過濾后用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。將終濃度為5×106/ml的淋巴細胞，加入24孔板（500μl/孔），Rpf E（10μg/ml）蛋白刺激。陰性對照用培養(yǎng)基代替刺激物；陽性對照用2μg/ml的刀豆蛋白Con A刺激，均設(shè)復(fù)孔。5%CO2孵箱中37℃共孵育72 h，收集培養(yǎng)液，參照試劑盒說明書檢測樣品中IFN－γ含量。

9.ELISPOT測定脾細胞分泌IFN－γ分泌能力：將分離的淋巴細胞，加入96孔ELISPOT板中（6×105/孔），給 予 ESAT6（9.09μg/ml）、Rpf E（9.09μg/ml）蛋白刺激，共孵育48 h后，按試劑盒說明書操作，依次加入檢測抗體等試劑，洗板、顯色，計數(shù)斑點數(shù)。

10.ELISA檢測抗體水平：用5μg/ml的蛋白ESAT6、Rpf E包被96孔板，100μl/孔，4℃過夜。洗滌后加入10%BSA（牛血清白蛋白）200μl/孔，37℃封閉1 h；洗滌后，從1∶100開始至1∶12 800，加入倍比稀釋的血清樣品100μl/孔，37℃孵育1 h；洗滌后，分別加入1∶15 000或1∶10 000稀釋的兔抗鼠IgG1、IgG2b 200μl/孔，37℃孵育1 h；洗滌后，加入 TMB（3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺）顯色液100μl/孔，顯色15 min后，加入終止液（1 mol H2SO4）50μl/孔，A450nm 檢測吸光度。

結(jié) 果

一、rpfE基因的PCR擴增及序列測定

以臨床Mtb基因組為模板，用合成的rpfE擴增引物進行PCR擴增，可擴增出長度為435 bp片段（圖1）。測序結(jié)果與GenBank上公布的 Mycobacterium tuberculosis CDC1551序列一致。

M：分子量標準；1：rpfE 基因；2：esat6 基因圖1 PCR產(chǎn)物的1%瓊脂凝膠電泳

二、重組載體的構(gòu)建及序列測定

PCR產(chǎn)物rpfE和重組質(zhì)粒p ET30a－esat6分別經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化。隨機篩選陽性克隆，進行PCR、酶切鑒定，可以得到285和435 bp的基因片段，證明克隆正確，測序再次驗證后，將陽性克隆命名為 p ET30a－esat6－rpfE。

三、融合蛋白表達及純化

ESAT6－Rpf E融合蛋白在大腸埃希菌中能穩(wěn)定高效表達，主要以包涵體形式存在。圖2顯示ESAT6－Rpf E蛋白的表達及純化結(jié)果，可見經(jīng)離子交換、疏水層析的方法純化，可得到高純度的ESAT 6－RpfE蛋白。

M：標 準 蛋 白；1：BL21 超 聲 上 清；2：ESAT6－Rpf E 超 聲 上 清；3：ESAT6－Rpf E超聲沉淀；4：純化的ESAT6－Rpf E蛋白圖2 ESAT6－Rpf E蛋白的誘導(dǎo)表達和純化分析

四、重組蛋白Rpf E的表達及純化

帶有His標簽的重組Rpf E蛋白，以上清的形式在大腸埃希菌中表達，圖3顯示Rpf E蛋白純化產(chǎn)物，經(jīng) Ni－NTA His－Bind柱（Novage）純化可以得到高純度的Rpf E蛋白。

五、免疫小鼠脾細胞誘導(dǎo)的IFN－γ水平

第一次實驗：ESAT6－Rpf E組，體外脾細胞受Rpf E刺激時分泌IFN－γ分泌水平［（6.88±3.17）μg/L］高 于 BCG 組 ［（1.48±1.02）μg/L，q＝5.535，P＜0.05］；顯著高于PBS組［（0±0）μg/L，q＝7.056，P＜0.01］（圖4）。第二次實驗：ESAT6－Rpf E組體外脾細胞用Rpf E刺激，分泌IFN－γ的脾淋巴細胞數(shù)量 ［（427.13±100.46）］顯著高于PBS組［（26.13±22.34），q＝7.924，P＜0.001］；用ESAT 6刺激，分泌IFN－γ的脾淋巴細胞數(shù)量［（506.50±140.40）］顯 著 高 于 PBS［（19.25±14.75），q＝11.36，P＜0.001］；顯著 高于 BCG 組 ［（125.5±46.41），q＝8.882，P＜0.001］（圖5）。

C57BL/6小鼠免疫8周脾淋巴細胞受Rpf E（10μg/ml）蛋白刺激分泌表達IFN－γ水平，佐劑為DDA。a：P＜0.05圖4 第一次實驗免疫小鼠脾細胞分泌IFN－γ水平

六、免疫小鼠血清特異性抗體檢測

ELISA方法檢測免疫小鼠血清ESAT6、Rpf E的特異性IgG1和IgG2b抗體水平（圖6）。生理鹽水對照組血清抗體為陰性；BCG免疫組未檢測到抗ESAT6抗體；較單個蛋白ESAT6、Rpf E組，融合蛋白ESAT6－RpfE引起體液免疫應(yīng)答強。

討 論

預(yù)防TB的主要手段是接種BCG，但是BCG對于防治TB在全球的流行效果不甚明顯［24］，對成人肺結(jié)核保護效果不佳，因此尋求互補或者替代BCG的疫苗刻不容緩。當前研究的新型疫苗包括重組BCG疫苗、構(gòu)建減毒突變株、蛋白疫苗、DNA疫苗及病毒載體疫苗等［25－29］。其中蛋白亞單位疫苗因其成分明確、使用安全、成本低，備受研究者的關(guān)注。疫苗免疫策略表明，初始－增強免疫策略可以提高疫苗的免疫效果，尤其提高成人肺結(jié)核免疫保護力［9］。故研究有效的亞單位疫苗加強BCG或重組BCG成為疫苗研究的主要方向［30］。本研究選擇了ESAT 6、RpfE 2種個抗原進行融合表達，其中ESAT6是Mtb早期分泌性蛋白，是效應(yīng)性T細胞的主要靶抗原，具有較強的免疫原性和良好的抗原刺激性［31］；Rpf E對BCG休眠菌具有復(fù)蘇作用。

1998年H37Rv全基因組序列的發(fā)表，使TB的研究有了突破性進展［32］?；蚪M信息在研究基因表達、為藥物研究篩選靶點中起著重要的作用［32］。H37Rv被廣泛作為標準毒力株來研究TB，然而Ioerger等［33］對來自不同實驗室的6種H37Rv菌株進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)有遺傳變異。過去認為Mtb尤其是H37Rv基因組比較穩(wěn)定，然而體內(nèi)體外的研究證實 Mtb一直在進化中［34－36］。所以僅僅拿過去的標準株來研究現(xiàn)在流行的TB存在一定的缺陷，因此本實驗采用臨床株作為模板擴增目的基因rpfE。在構(gòu)建原核表達載體時，筆者設(shè)計去除rpfE的信號肽［預(yù)測信號肽的切除位點ANA‖DD（28－29）［22－23］的引物，擴增出rpfE 基因片段，序列比對發(fā)現(xiàn)該基因序列與Mtb CDC1551一致。Mtb CDC1551菌株是在1994—1996年暴發(fā)的TB中分離出來的，因其感染率高及PPD反應(yīng)強烈［37］，引起研究人員的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)CDC1551能誘導(dǎo)快速強烈的宿主反應(yīng)，推斷其產(chǎn)生的免疫刺激因子能誘導(dǎo)強的Th1型反應(yīng)，從而減慢疾病進展［38］。

后基因組學(xué)時代利用融合蛋白的標簽選擇性與層析基質(zhì)上的配體結(jié)合的原理來純化蛋白。該方法無需了解蛋白質(zhì)的生化特性或生理活性，可以純化任何蛋白。但是進一步研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和臨床應(yīng)用，就應(yīng)避免親和標簽所帶來的潛在干擾［39］，過去主要通過蛋白酶、內(nèi)含肽剪切融合蛋白來獲得天然無標簽蛋白。然而針對某些特定的融合蛋白，此剪切過程比較困難。本研究在構(gòu)建原核表達載體時，去除了標簽，避免了再剪切標簽的過程，生產(chǎn)工藝更加便利。

本研究選擇了DDA為佐劑。因為DDA毒性低，可誘導(dǎo)較強的細胞免疫反應(yīng)［40－41］，且已有多個以DDA為佐劑的重組蛋白疫苗進入臨床實驗［42］。一直以來，IFN－γ分泌水平作為評價疫苗保護性的一 個 指 標［1，43－46］。 本 研 究 檢 測 結(jié) 果 表 明，針 對ESAT6－Rpf E的組分 Rpf E 刺激，ESAT6－Rpf E 組免疫小鼠脾淋巴細胞分泌的IFN－γ水平最高，Rpf E組及BCG組均次之，說明融合蛋白ESAT6－Rpf E保留了Rpf E的免疫原性。在佐劑DPG的輔助下，ELISPOT檢測脾細胞分泌IFN－γ的細胞數(shù)。ESAT6－Rpf E組受ESAT6、Rpf E蛋白刺激時，明顯高于PBS及BCG組。抗體水平檢測發(fā)現(xiàn)ESAT6、Rpf E、ESAT6－Rpf E組小鼠血清均能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，ESAT6－Rpf E組引起體液免疫應(yīng)答較單個蛋白ESAT 6、RpfE組強。綜上所述，融合蛋白ESAT 6－Rpf E保留了ESAT6和Rpf E兩個抗原的免疫原性。為排除細菌內(nèi)毒素對實驗結(jié)果的影響，筆者檢測了蛋白的內(nèi)毒素含量，其結(jié)果為5EU（endotoxin unit，內(nèi)毒素的效價單位）/ml，符合生物制品的要求。本研究成功構(gòu)建了esat6－rpfE原核表達載體，表達、純化融合蛋白，并初步研究了融合蛋白的免疫原性，該疫苗能誘導(dǎo)較強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，可作為新型結(jié)核亞單位疫苗的候選疫苗予以進一步研究。

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