趙文然，鐘學(xué)寬，張淑娟，沃曉嫚，張中海，王博，鐘照華

1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，哈爾濱 150086； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)地方病防治研究中心，哈爾濱 150086； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，哈爾濱 150086

柯薩奇病毒B組(coxsackie virus B，CVB)是引起病毒性心肌炎的主要病原體，在一部分患者CVB感染可發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病[1-3]。在研究CVB感染時(shí)，通常要對(duì)細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的病毒感染情況進(jìn)行定性或定量分析，或需要明確病毒在體內(nèi)復(fù)制的部位及強(qiáng)度。對(duì)病毒感染的定性分析方法通常為觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)，而定量分析常用方法包括測(cè)定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)、噬斑形成單位(plaque forming unit, PFU)，或通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)測(cè)定感染細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸含量[4-7]。以上幾種方法雖然很可靠，但除了對(duì)病毒感染細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察以外，其他方法均很耗時(shí)，且操作復(fù)雜。近年來(lái)，廣泛應(yīng)用的生物標(biāo)記技術(shù)既可對(duì)病毒感染進(jìn)行定性、定量分析，又可對(duì)病毒在體內(nèi)感染過(guò)程進(jìn)行示蹤[8-11]。熒光報(bào)告基因標(biāo)記是目前常用的生物標(biāo)記方法之一，其中編碼紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的報(bào)告基因mCherry可用于研究多種病原體感染。mCherry的波長(zhǎng)相對(duì)較長(zhǎng)，可避免體內(nèi)自發(fā)綠熒光的干擾[10,11]。對(duì)RNA病毒而言，由于RNA聚合酶缺乏糾錯(cuò)功能，病毒在復(fù)制過(guò)程中易產(chǎn)生基因突變[12-14]。這一特點(diǎn)可能影響重組RNA病毒基因組的穩(wěn)定性[15]。因此，如果要通過(guò)紅色熒光蛋白的表達(dá)對(duì)柯薩奇病毒B組3型(coxsackie virus B3，CVB3)的復(fù)制進(jìn)行定性和定量分析，則有必要了解含mCherry報(bào)告基因的重組CVB3基因組的穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞及主要試劑 pMKS1由J. Lindsay Whitton教授(The Scripps Research Institute，California)惠贈(zèng)。質(zhì)粒peGFP-N1購(gòu)自Clontech公司。重組質(zhì)粒pCVB3-mCherry(圖1)攜帶嗜心肌的CVB3 H3毒株基因組全長(zhǎng)cDNA及紅色熒光蛋白mCherry基因編碼序列由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室構(gòu)建。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14]，即以pMKS1為基礎(chǔ)，將序列兩端含內(nèi)切酶SfiI識(shí)別序列的mCherry基因插入CVB3基因組5′端。mCherry的激發(fā)波長(zhǎng)為580 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm。HeLa細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA小量膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。DL2000 DNA Ladder、DL15000 DNA Ladder、pMD19-T Simple Vector、LATaq聚合酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司。真核轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購(gòu)自以色列Biological Industries公司(Cat: 04-001-1A；Lot: 215356)。中性紅細(xì)胞染色液購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞核染料Hoechst 33342購(gòu)自Invitrogen公司，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm。

圖1 CVB3-mCherry的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of CVB3-mCherry

1.1.2 主要儀器 主要儀器包括Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf)和Axiovert 200相差倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)。

1.1.3 主要軟件及網(wǎng)站 Gene runner用于引物設(shè)計(jì)及多重序列比對(duì)；數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST用于基因組結(jié)構(gòu)查詢及序列比對(duì)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pCVB3-mCherry的擴(kuò)增與純化 取保存于-80 ℃含重組質(zhì)粒pCVB3-mCherry的菌液適量，接種于5 ml含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床振搖12～16 h(180 r/min)，可見(jiàn)液體渾濁。取1.5 ml菌液加入離心管中，122 000g離心1 min，棄上清液。用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，檢測(cè)濃度及純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pCVB3-mCherry在HeLa細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，24 h后選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且生長(zhǎng)至70%～90%單層細(xì)胞，用OPTI-MEMI培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體和質(zhì)粒pCVB3-mCherry。轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比為2 μl∶0.8 μg；轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(peGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞)、陰性對(duì)照及未經(jīng)任何處理的HeLa細(xì)胞對(duì)照；置培養(yǎng)板于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察熒光表達(dá)及細(xì)胞病變情況。

1.2.3 病毒的收獲及傳代 用pCVB3-mCherry轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，當(dāng)70%～90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，于2 000g、4 ℃離心10 min，收集上清液，稱為第1代病毒，儲(chǔ)存于-80 ℃。用第1代病毒感染HeLa細(xì)胞，待70%～90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次，離心后收集上清液，稱為第2代病毒。以此類推，將病毒連續(xù)傳至第6代。

1.2.4 噬斑形成實(shí)驗(yàn)及病毒毒力測(cè)定 將HeLa細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層無(wú)縫隙時(shí)，用DMEM倍比稀釋 (10倍稀釋) 的病毒接種。每孔加入病毒稀釋液650 μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，棄病毒稀釋液；每孔加入2 ml固體培養(yǎng)基(含5% FCS的2×DMEM和1.6% 瓊脂糖，1∶1配制)，放入濕盒，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，30 min后倒置培養(yǎng)72 h。鏡下觀察熒光表達(dá)及CPE，根據(jù)CPE情況進(jìn)行染色。于細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.05%中性紅染色液，室溫作用1 h，棄染液。挑選培養(yǎng)板中噬斑未融合且噬斑個(gè)數(shù)適中的培養(yǎng)孔，鏡下計(jì)數(shù)噬斑個(gè)數(shù)，按以下公式計(jì)算病毒毒力：PFU/ml=每個(gè)稀釋濃度噬斑的平均值/(病毒的稀釋濃度×每孔病毒接種量)。

1.2.5 重組毒株的純化及穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 取第1代病毒用于噬斑形成實(shí)驗(yàn)。挑取單個(gè)噬斑，接種于HeLa細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增(100 ml規(guī)格培養(yǎng)瓶)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；當(dāng)90%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，收獲病毒，此為純化后的CVB3-mCherry第1代病毒。以同樣方法純化第2～6代病毒。分別提取每代病毒總RNA，用RT-PCR擴(kuò)增重組毒株中的mCherry報(bào)告基因及CVB3基因組部分序列，經(jīng)0.7%瓊脂糖電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小。

HeLa cells transfected with pCVB3-mCherry in light microscopy (A) and fluorescence microscopy (B). Scale bar, 100 μm.

NC：HeLa cells without CVB3-mCherry infection； CVB3-mCherry: HeLa cells infected with the first passage of CVB3-mCherry.

A: RT-PCR strategy to analyze the stability of CVB3-mCherry. B: RT-PCR results. C : Cytopathic effect of CVB3-mCherry in HeLa cells in light and fluorescence microscopy. Panel 0 represents HeLa cells without virus infection. Panel 2-6 represent HeLa cells infected with the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

PCR引物序列如下：上游引物(P1)5′-GGCGGCAGTGTGTCGTAACGGGC- AAC-3′(CVB3的5′ UTR區(qū))，下游引物(P2)5′-GCGTGGTTCTGTGAACTTGCCCGGG-3′(CVB3的VP4區(qū))。如果重組病毒基因組攜帶mCherry基因，擴(kuò)增片段預(yù)期為1 160 bp；如果重組病毒基因組丟失報(bào)告基因mCherry，擴(kuò)增片段應(yīng)為455 bp。用pCVB3-mCherry、pMKS-1作為擴(kuò)增模板的陽(yáng)性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照。將擴(kuò)增產(chǎn)物各片段用凝膠回收法純化，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序(北京英駿公司)后分析目的片段丟失規(guī)律。測(cè)序引物為PMD19T載體通用引物，引物序列為M13F-47(CGCCAGG-GTTTTCCCAGTCACGAC)和M13R-48(AGCG-GATAACAATTTCACACAGGA)。

2 結(jié)果

2.1 pCVB3-mCherry在HeLa細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

用pCVB3-mCherry轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)60 h 后，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)CPE，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)紅色熒光(圖2)，表明CVB3-mCherry可感染細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，可用于CVB感染的體外研究。

2.2 CVB3-mCherry的毒力

用重組質(zhì)粒pCVB3-mCherry轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染60 h后檢測(cè)到紅色熒光，收獲第1代重組病毒，用噬斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)得病毒毒力為9.3×106PFU/ml(圖3)。

2.3 CVB3-mCherry的穩(wěn)定性

提取各代CVB3-mCherry基因組RNA，用于RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果(圖4B)顯示，第2代和第3代重組病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物于1 160 bp處有較亮的條帶，455 bp處未見(jiàn)到條帶，但可見(jiàn)長(zhǎng)度<455 bp的片段。隨著傳代次數(shù)遞增，擴(kuò)增產(chǎn)物中的1 160 bp片段顯示的條帶逐漸模糊；同時(shí)，長(zhǎng)度<455 bp的未知片段則隨病毒傳代次數(shù)的增加而變得清晰。此結(jié)果表明，報(bào)告基因mCherry的丟失開(kāi)始于重組病毒的第2代；在mCherry基因片段丟失的同時(shí)，部分CVB3基因片段也隨之丟失。然而，第2～6代重組病毒所致的CPE沒(méi)有顯著區(qū)別(圖4C)。

將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中3個(gè)長(zhǎng)度<455 bp的小片段回收純化，經(jīng)TA克隆后測(cè)序，與重組質(zhì)粒pCVB3-mCherry進(jìn)行序列比對(duì)。其中RT-PCR獲得的3個(gè)小片段長(zhǎng)度分別為435 bp、326 bp和256 bp。435 bp片段的產(chǎn)生是由于重組病毒丟失了包括插入的SfiI酶切位點(diǎn)及mCherry全序列，并因此導(dǎo)致病毒開(kāi)放讀碼框架(open reading frame，ORF)移位，但無(wú)病毒基因序列丟失；326 bp片段的產(chǎn)生是由于丟失了mCherry及病毒的VP4區(qū)部分序列；而256 bp片段的產(chǎn)生則是mCherry和CVB3 ORF全部丟失的結(jié)果(表1、圖5)。

3 討論

CVB為單股正鏈RNA病毒，能引起人類多種疾病，可侵犯心臟、脊髓、胰腺、腎臟、腦等多個(gè)重要器官，是病毒性心肌炎的主要病原體[1-3]。目前，對(duì)CVB感染進(jìn)行定性和定量的診斷方法仍以形態(tài)學(xué)觀察、測(cè)定PFU及RT-PCR為主。近年來(lái)熒光報(bào)告基因標(biāo)記也廣泛用于病毒檢測(cè)。該方法更便捷，可用于病毒感染的定量分析及動(dòng)態(tài)觀察，但目前對(duì)于攜帶熒光報(bào)告基因的重組CVB基因組的穩(wěn)定性仍缺乏了解。

本研究結(jié)果表明，重組體CVB3-mCherry能在HeLa細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并產(chǎn)生明顯的CPE，可通過(guò)觀察紅色熒光蛋白表達(dá)情況來(lái)評(píng)價(jià)CVB的感染情況。此方法快速、簡(jiǎn)便。與其他普通的紅色熒光蛋白相比，mCherry的優(yōu)點(diǎn)在于有較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)、單體形式、在細(xì)胞內(nèi)熒光轉(zhuǎn)換效率高，因而具有較高的信噪比，更易被檢測(cè)到；其次，檢測(cè)時(shí)無(wú)需底物，只需激發(fā)光，既方便又節(jié)約成本[10,11]。

Red thin lines represent the locations of the fragments obtained from the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

表1 重組病毒CVB3-mCherry與其突變體基因序列分析結(jié)果比對(duì)Fig.1 Sequence alignment between the recombinant CVB3-mCherry and its mutated progenies

(續(xù)表)

(續(xù)表)

* represents the nucleotide that is retained in CVB3-mCherry; - represents the nucleotide that has been lost from CVB3-mCherry.

基因組不穩(wěn)定是小RNA病毒的共同特征[12-14]。有研究報(bào)道，與報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)重組后，CVB基因組變得不穩(wěn)定，在傳代過(guò)程中會(huì)丟失報(bào)告基因及部分CVB基因序列[15]。因此推測(cè)，隨著傳代次數(shù)的增加，CVB3-mCherry毒株的穩(wěn)定性也可能有所變化。本研究表明，從第2代開(kāi)始，重組病毒中就發(fā)生了報(bào)告基因丟失。丟失的序列包括插入的報(bào)告基因mCherry、CVB的5′ UTR區(qū)及部分VP4區(qū)。而第4～6代的重組病毒更不穩(wěn)定，其中未發(fā)生基因片段丟失的病毒數(shù)量逐漸減少，表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物中1 160 bp處的條帶越來(lái)越模糊，而發(fā)生基因丟失的病毒數(shù)量逐漸增加。序列分析表明，由于核酸序列丟失導(dǎo)致病毒ORF移位，因此會(huì)產(chǎn)生致死性突變株，使病毒失去原有的感染性。

本研究結(jié)果表明，與含報(bào)告基因eGFP的重組CVB3類似[15]，重組CVB3-mCherry基因組也具有不穩(wěn)定的特點(diǎn)。雖然從第2～6代重組病毒所致的CPE看不出顯著變化，但包括CVB3自身基因片段在內(nèi)的基因序列丟失從第2代就已存在。因此，應(yīng)用時(shí)病毒傳代次數(shù)不宜超過(guò)2代；長(zhǎng)期應(yīng)用則需重新用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞以收獲病毒。此外，應(yīng)通過(guò)噬斑形成實(shí)驗(yàn)純化CVB3-mCherry毒株并測(cè)定其毒力。盡管如此，該重組體仍不失為研究CVB的方便且可靠的工具。

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