佟 琳 楊學(xué)習(xí) 李粉霞 孫敏英 劉民鋒 董建宇 郭昭澤 葉長(zhǎng)生

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院乳腺科，廣州510515)

目前，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤。 2008年全球乳腺癌新增病例約138萬，占所有新發(fā)癌癥病例的22.9%(IARC：Cancer Epidemiology Database， GLOBOCAN.2008 ［http：//www-dep.iarc.fr］)。近幾年，雖然美國(guó)等西方發(fā)達(dá)國(guó)家的乳腺癌發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢(shì);但在中國(guó)卻逐年增長(zhǎng)，2008年中國(guó)乳腺癌新發(fā)病例(16.9萬)比2002年(12.6萬)(IARC：Cancer Epidemiology Da-tabase，GLOBOCAN.2002 ［http：//www-dep.iarc.fr/］)增長(zhǎng)了34%。

HLA是機(jī)體免疫識(shí)別，免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)［1］。它決定機(jī)體的組織相容性，并以其多基因性和高度多態(tài)性成為人類的重要遺傳標(biāo)記［2］。HLA基因定位于人類染色體6p21.3區(qū)域，可分為HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、HLA-Ⅲ 3 個(gè)區(qū)域。目前已證明HLA參與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視過程，與多個(gè)系統(tǒng)性疾病存在相關(guān)性［2-4］。HLA-Ⅰ類分子廣泛分布于人體有核細(xì)胞表面，參與內(nèi)源性抗原肽的加工、處理和提呈［5］。HLA-Ⅰ已被證實(shí)與多種腫瘤易感性相關(guān)［6-8］。HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)降低、缺失是腫瘤細(xì)胞的一種逃逸方式，主要機(jī)制為針對(duì)HLA-Ⅰ類分子向T細(xì)胞遞呈的免疫原性多肽無法被識(shí)別，從而無法殺傷腫瘤細(xì)胞［9］。此外，HLA-Ⅰ還是預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的有效指標(biāo)［10］，但HLA-Ⅰ基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)與乳腺癌之間的關(guān)系尚不清晰。本文選取了HLA-Ⅰ基因編碼區(qū)的17個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，采用病例對(duì)照研究，通過 Sequenom MassArray?iPLEX GOLD系統(tǒng)，對(duì)中國(guó)南方漢族乳腺癌患者267例及健康對(duì)照組274例進(jìn)行基因分型分析，探究其多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2009年5月12日到2010年7月2日，收集廣州南方醫(yī)院、廣州軍區(qū)總醫(yī)院、江西南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院、湛江廣東醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診的乳腺癌患者血液標(biāo)本267例，平均年齡為(47.8±9.28)歲，中位年齡為47歲。同期收集相應(yīng)醫(yī)院體檢健康女性274人，要求無乳腺相關(guān)病史，無乳腺癌家族史和其它腫瘤病史，平均年齡(51±16.7)歲，中位年齡為49歲。所有對(duì)象均為中國(guó)南方漢族女性且相互間無血緣關(guān)系，獲得知情同意后，取外周血1～2 ml于酸性枸櫞酸葡萄糖抗凝管中，-80℃保存待用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取 取外周靜脈血200 μl，用DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit)提取DNA(按說明書操作)，DNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)HLA-Ⅰ編碼區(qū)域的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn)，利用Sequenom MassArray?Assay Design 3.1軟件設(shè)計(jì)多重PCR特異性擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，其中針對(duì)各位點(diǎn)的PCR特異性擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物見表1。

表1 17個(gè)位點(diǎn)的PCR特異性擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物Tab．1 Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 17 SNPs

1.2.3基因分型分析 采用 MassArray?-IPLEX SNP分型技術(shù)對(duì)所選樣本進(jìn)行基因分型，步驟如下：將提取純化后的基因組DNA取1.0 μl，按順序加于特定的384孔板上，再添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下：0.1 U的Taq聚合酶，5 ng基因組DNA，各2.5 pmol的 PCR 引物，2.5 mmol的 dNTP。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 2分鐘;95℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒循環(huán)45次;72℃ 5分鐘;在上述體系中添加0.3 U的堿性磷酸酶，經(jīng)37℃ 40分鐘，85℃5分鐘的反應(yīng)去除剩余的dNTP;向體系中添加5.4 pmol的各延伸引物，50 μmol的 dNTP/ddNTP 混合物，0.5 U的Thermosequenase DNA聚合酶，反應(yīng)條件為：94℃ 2分鐘;94℃ 5秒，50℃ 5秒，72℃ 5秒循環(huán)40次;72℃ 3分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物用樹脂脫鹽15分鐘后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片，點(diǎn)樣結(jié)束后的芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SpectroREADER，Sequenom)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證基因分型成功率為95%以上。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 對(duì)所選17個(gè)位點(diǎn)的基因型分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，以在線分析工具h(yuǎn)ttp：//bioinfo.iconcologia.net/SNPStats和統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行病例-對(duì)照和受體狀態(tài)相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)分析，再將病例組樣本按免疫組化結(jié)果中雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)狀態(tài)分為陽性組和陰性組。分析過程中采用共顯性(codominant)、顯性(dominant)、隱性(recessive)、超顯性(overdominant)四種遺傳模型。χ2檢驗(yàn)分析不同分組的基因型頻率有無差異，非條件Logistic回歸計(jì)算比數(shù)比OR和95%可信區(qū)間(95%CI)，由此評(píng)估所選位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

表2 不符合Hardy-Weinberg平衡的位點(diǎn)的基因型分布Tab．2 Distribution of SNPs inconsistent with the Hardy-Weinberg equilibrium

本研究所選位點(diǎn)在檢測(cè)樣本中均存在多態(tài)性，其中 7 個(gè)位點(diǎn) rs2517749、rs1632902、rs4087726、rs9260475、rs9260489、rs9260571、rs9260619 不符合Hardy-Weinberg平衡(表2)，遂在隨后的統(tǒng)計(jì)分析析中不在包括在內(nèi)。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs9260682與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和HER-2狀態(tài)存在相關(guān)性，rs9260682的AT基因型可增加攜帶者乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.04)，且與HER-2陰性乳腺癌相關(guān)(P=0.04)。rs9260734雖與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不存在顯著相關(guān)性，但AA基因型與PR陰性乳腺癌相關(guān)(P=0.048)，具體結(jié)果見表4;其余8個(gè)位點(diǎn)rs9404952、 rs9295822、 rs6921314、 rs1632882、rs2517716、rs1632879、rs16896742、rs2571400 基因型分布在病例-對(duì)照、ER陽/陰性、PR陽/陰性、HER-2陽/陰性分組中均未顯示有明顯相關(guān)性(表3)。

表3 與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)無明顯關(guān)系的位點(diǎn)的基因型分布Tab．3 Distribution of insignificant SNPs in case-control studies

表4 rs9260682位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab．4 The association of rs9260682 polymorphisms and breast cancer risk

表5 rs9260734位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性Tab．5 The association of rs9260734 polymorphisms and breast cancer risk

2.1 位點(diǎn)rs9260682多態(tài)性與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態(tài)的相關(guān)性分析 rs9260682在中國(guó)南方漢族女性存在AA、AT兩種多態(tài)性，在總體樣本中的分布頻率分別為96%、4%，在不同組別中的分別頻率如表4。該位點(diǎn)兩種基因型分布在病例-對(duì)照分組中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.04)，表明該位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌易感性明顯相關(guān);在ER陽/陰性、PR陽/陰性分組比較中發(fā)現(xiàn)，基因型分布雖有一定差異，但均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.76、P=0.50);HER-2分組比較結(jié)果顯示，該位點(diǎn)的多態(tài)性分布與乳腺癌HER-2狀態(tài)明顯相關(guān)(P=0.04)，攜帶雜合型AT者比純合型AA相比更傾向于HER-2陰性乳腺癌(OR=0.14，95%CI：0.02-1.23)。

2.2 位點(diǎn)rs9260734多態(tài)性分析與乳腺癌及ER、PR和HER-2狀態(tài)的相關(guān)性分析 rs9260734存在AA、GA、GG三種多態(tài)性，在總體研究樣本中的分布頻率分別12%、45%、43%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型分布在病例-對(duì)照、ER陽/陰性和HER-2陽/陰性分組中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5);但在PR分組比較中發(fā)現(xiàn)rs9260734的多態(tài)性分布與PR狀態(tài)明顯相關(guān)(P=0.048)，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性乳腺癌(OR=0.44，95%CI：0.19-1.01)。

3 討論

乳腺癌的發(fā)病是多基因的作用結(jié)果，通過對(duì)乳腺癌易感基因的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，BRCA1和BRCA2是家族性乳腺癌的罪魁禍?zhǔn)?。除了尋找易感基因，篩查易感性SNP位點(diǎn)也是乳腺癌基礎(chǔ)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。作為第三代遺傳標(biāo)記，SNP更適合作為生物標(biāo)記在普通人群中進(jìn)行檢測(cè)。全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies，GWAS)以大規(guī)模群體DNA樣本的SNP進(jìn)行全基因組高密度遺傳變異檢測(cè)，并利用有效統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算進(jìn)行病例-對(duì)照分析，計(jì)算出基因分型變異頻率的差異，最終達(dá)到相關(guān)的變異與疾病的關(guān)聯(lián)分析，從而確定特定基因型的個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)施個(gè)性化預(yù)防策略。目前通過GWAS關(guān)聯(lián)分析研究，已發(fā)現(xiàn)與乳腺發(fā)病相關(guān)的數(shù)十個(gè)基因，如 ABHD8、ANKRD16、CCND1、CDKN2A、CDKN2B、ECHDC1、ESR1、FGFR2、GLG1、GRIK1、KLF4、MAP3K1、MRPS30、TOX3 等的上百個(gè) SNP 位點(diǎn)［11-26］，為了解乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制及易感因素提供了更多的線索。但GWAS研究也存在局限性，對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤易感位點(diǎn)需進(jìn)行大樣本，多人群及相應(yīng)的功能機(jī)制分析。

HLA與許多系統(tǒng)疾病，如運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和感染性疾病等都存在相關(guān)性［6-8］，尤其是參與免疫調(diào)節(jié)及應(yīng)答［27］。此外，HLA還參與腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視，在許多腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要的作用，目前已有研究顯示HLA的多態(tài)性與腫瘤發(fā)生的易感性相關(guān)［6，28，29］。根據(jù)千人基因組計(jì)劃(http：//www.1000qenomes.orq/)，我們?cè)?HLA-Ⅰ選取了17個(gè)SNP位點(diǎn)，探討HLA-Ⅰ基因多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)有7個(gè)位點(diǎn)不符合Hardy-Weinberg平衡。這與HLA基因多態(tài)性豐度極高有關(guān)，很多關(guān)于HLA及疾病的關(guān)聯(lián)研究會(huì)面臨所獲得的數(shù)據(jù)最終不符合Hardy-Weinberg平衡的問題［30］。

目前有較多證據(jù)顯示，HLA多態(tài)性與肝癌、白血病、卵巢癌、宮頸癌等多種癌癥易感性相關(guān)［7，8，31，32］。乳腺癌為女性最常見惡性腫瘤，HLA與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。早在1990年就發(fā)現(xiàn)HLA在乳腺癌組織表達(dá)顯著低于癌旁組織［33］。轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織HLA-Ⅰ的表達(dá)亦顯著下降［34］。此外，有研究顯示乳腺癌患者HLA-Ⅰ蛋白表達(dá)程度與腫瘤分級(jí)明顯相關(guān)［10，35，36］，且發(fā)現(xiàn) HLA-Ⅰ表達(dá)越低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多及無病生存期越短(P＜0.05)［10］。Chardhuri［37］首先發(fā)現(xiàn) HLA 區(qū)域 DQB3*02017/*0202等位基因與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。David［38］在對(duì)墨西哥散發(fā)乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)HLAI基因上DRB1*1602和DQ*0301位點(diǎn)與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，其他研究同樣顯示HLA-Ⅰ與乳腺癌明顯相關(guān)［39，40］，但這些數(shù)據(jù)主要以西方人群為基礎(chǔ)，目前尚無中國(guó)人群的相關(guān)報(bào)道。本研究在中國(guó)南方漢族女性中首次發(fā)現(xiàn)HLA-I基因上的rs9260682與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道該位點(diǎn)與鼻咽癌易感性同樣相關(guān)［41］，但目前尚無該位點(diǎn)與乳腺癌易感性的相關(guān)性研究。

ER、PR、HER-2為乳腺癌指導(dǎo)預(yù)后及臨床治療的重要指標(biāo)，已成為臨床上常規(guī)檢查項(xiàng)目。ER、PR表達(dá)陽性的乳腺癌為激素敏感性患者，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)低，預(yù)后較好，且適于內(nèi)分泌治療。HER-2蛋白過表達(dá)與乳腺癌惡性程度呈正相關(guān)，是重要的預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)HER-2表達(dá)情況為臨床使用赫賽汀靶向治療提供依據(jù)。因此本研究聯(lián)合以上指標(biāo)來分析HLA遺傳多態(tài)性與其狀態(tài)的相關(guān)性。結(jié)果顯示rs9260734與PR陰性相關(guān)，AA基因型攜帶者更傾向于PR陰性;rs9260682除與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)外，其AT基因型比AA基因型更傾向于HER-2陰性乳腺癌。

通過對(duì)HLA-I區(qū)域17個(gè)SNPs位點(diǎn)與乳腺癌易感性及受體狀態(tài)的相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)rs9260682與中國(guó)南方漢族女性中乳腺癌易感性及HER-2陰性相關(guān)，rs9260734與乳腺癌PR陰性相關(guān)。該研究不僅有助于探討HLA-I在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，也可為乳腺癌的早期診斷和個(gè)體化醫(yī)療提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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