王 鶴 于繼云 李 力 (廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬新增病例，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。過去15年的流行病學和病毒學資料已經(jīng)證明：人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素，且為始動因素。幾乎所有宮頸癌細胞中都有HPV DNA和病毒轉(zhuǎn)化蛋白的表達。雖然根據(jù)流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界80%的宮頸癌與4個高危型16，18，31和45相關(guān)，但據(jù)我國最近完成的兩項中國與亞洲婦女子宮頸中HPV型別分布的Meta研究結(jié)果顯示［1］：HPV58型在我國宮頸癌婦女中是繼HPV16和18之后的第三重要型別。由于HPV58型分布具有較強的區(qū)域性，僅在亞洲婦女中檢出率較高，因此，目前國內(nèi)外對于HPV58的研究還較少。鑒于HPV58型在我國宮頸癌發(fā)病中的特殊地位，HPV58型疫苗研制是非常必要的。HPV的E6、E7基因在鱗狀上皮病變和宮頸癌中是持續(xù)表達的，這種持續(xù)表達既是腫瘤細胞轉(zhuǎn)化和維持惡性特征所必需，也可作為抗原持續(xù)刺激受感染者的免疫系統(tǒng)，因此成為研制HPV感染相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性疫苗的理想靶抗原［2］。但因E6和E7是癌蛋白，具有轉(zhuǎn)化活性，為保證疫苗在人體內(nèi)的使用安全，必須首先去除E6和E7的轉(zhuǎn)化活性并保留其抗原性。我們在前期研究中已消除HPV58型E6、E7基因轉(zhuǎn)化活性，本研究隨后構(gòu)建出上游表達融合抗原HPV58mE6E7和人IgG Fc段、下游表達分子佐劑hIL12的新型復合DNA疫苗載體PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12，并采用流式細胞術(shù)、免疫熒光及ELISA分別檢測該疫苗載體的真核表達情況，為該疫苗載體的療效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株和細胞株 點突變后的pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成;真核表達載體 pCI-Fc-GPI、疫苗載體PVAX1-IRES-hIL12由本室自行構(gòu)建保存;大腸桿菌DH5α和人胚腎細胞293T由本實驗室保存。

1.1.2工具酶和試劑 Ex Taq DNA聚合酶、SolutionⅠ快速連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品;DNA限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒和DNA片段純化試劑盒均購自北京三博遠志科技公司;DNA電泳用瓊脂糖購自BIOWEST AGAROSE公司;G418購自Merker公司;氨芐青霉素、卡那霉素、青霉素和鏈霉素為華北制藥有限公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Wizard?Plusminipreps DNA Purification system)購自Promega公司;細胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000 Reagent購自Invitrogen公司。

1.1.3抗體和試劑盒 鼠抗HPV16 E7單克隆抗體和HRP標記山羊抗鼠IgG抗體均購自Santa Cruz公司;FITC標記的山羊抗人IgG購自北京中杉金橋技術(shù)有限公司;人白介素12 ELISA檢測試劑盒為深圳達科為有限責任公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HPV58mE6E7融合基因的獲得 點突變后的HPV58mE6E7融合基因序列交由北京擎科生物技術(shù)有限公司全基因合成(片段上下游分別帶有XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點)并連接到pGEM-T easy載體，構(gòu)建成功pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定。

1.2.2重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的構(gòu)建及鑒定 pGEM-T easy/HPV58mE6E7質(zhì)粒與pCI-Fc-GPI真核表達載體同時用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切體系為 50 μl：底物 10 μl、Buffer EcoRⅠ 5 μl、XhoⅠ 1 μl、EcoR Ⅰ 1 μl、100 × BSA 0.5 μl、水 32.5 μl。雙酶切后的 HPV58E6E7 融合基因片段和pCI-Fc-GPI載體分別純化回收后經(jīng)SolutionⅠ快速連接酶連接后轉(zhuǎn)化入E．coli.DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)皿篩選，挑取陽性克隆搖菌提質(zhì)粒，進行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，陽性者送公司測序，最終鑒定正確者命名為pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。

1.2.3重組疫苗質(zhì)粒PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12(簡稱 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12)的構(gòu)建及鑒定 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和本室前期構(gòu)建的新型疫苗載體PVAX1-IRES-hIL12分別先用NotⅠ和ClaⅠ單酶切，純化后用Klenow酶補平，再用NheⅠ單酶切后切膠回收分別得到sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段和載體。將片段和載體用SolutionⅠ快速連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli DH5α，經(jīng)卡那霉素培養(yǎng)皿篩選后，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，進行NheⅠ和PvuⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確者送公司測序，最終鑒定正確者即為復合基因DNA疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12，簡 稱 PVAX1-HPV58mE6E7 Fc-hIL12。

1.2.4重組質(zhì)粒PVAX1-HPV58mE6E7 Fc-hIL12的瞬時轉(zhuǎn)染 真核表達采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細胞。取對數(shù)生長期的293T細胞，胰酶/EDTA常規(guī)消化后接種于6孔培養(yǎng)板中，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后待其匯合度達到70% ～80%時，提取鑒定正確的重組質(zhì)粒PVAX1-HPV58mE6E7 FchIL12，在脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的介導下轉(zhuǎn)染293T細胞，空白對照組只加入等量的空白脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染完畢后將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后6小時更換含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48小時收集轉(zhuǎn)染細胞進行檢測。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測PVAX1-HPV58mE6E7FchIL12中sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的表達 ①收集轉(zhuǎn)染細胞48小時的293T細胞，用4℃預冷含2%小牛血清的PBS 1ml重懸細胞(轉(zhuǎn)入EP管進行后續(xù)操作)，洗滌細胞2次(不用間隔)，5 000 r/min×20秒，離心去上清;②同時加入由PBS按1∶100稀釋的FITC標記的山羊抗人IgG抗體100 μl和1∶200稀釋PE標記兔抗人B7.1抗體100 μl，混勻，冰浴，避光輕度震蕩30分鐘;5000 r/min×30秒，離心去上清;③4℃預冷含2%小牛血清的PBS 500 μl洗滌2次，冰浴震蕩，間隔3～5分鐘，5 000 r/min×30秒，離心去上清;④加入1%多聚甲醛500 μl固定后，進行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.6瞬時轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測 收集轉(zhuǎn)染細胞48小時的293T細胞，按照1.2.5中所述步驟染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察表達情況并拍照。

1.2.7hIL12分泌表達的驗證 檢測PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12重組質(zhì)粒中 IRES下游的hIL12的表達：瞬時轉(zhuǎn)染48小時后取細胞培養(yǎng)液上清，3 000 r/min離心20分鐘吸取上清，以空白細胞培養(yǎng)上清作為對照，將轉(zhuǎn)染后細胞的上清分別稀釋5倍后，按達科為有限責任公司人白介素12 ELISA檢測試劑盒說明步驟進行操作，每個樣品做3個復孔，顯色后用Bio-RAD酶標儀450 nm讀取OD值，并做標準曲線，計算上清中hIL12濃度。

2 結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI經(jīng)XhoⅠ 和 EcoRⅠ雙酶切后，可切下大小為753 bp的HPV58mE6E7目的基因片段(圖1)。

2.2復合DNA疫苗載體PVAX1-HPV58mE6E7FchIL12的構(gòu)建及鑒定 基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI與載體PVAX1-IRES-hIL12連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆提質(zhì)粒后經(jīng)NheⅠ和PvuⅠ雙酶切鑒定證實，目的基因sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI(2.2 kB)已連入PVAX1-IRES-hIL12中(見圖2)，重組質(zhì)粒送測序證實PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-hIL12 DNA疫苗構(gòu)建成功，簡稱為PVAX1-HPV58m E6E7Fc-hIL12。

2.3瞬時轉(zhuǎn)染細胞的流式細胞術(shù)分析 瞬時轉(zhuǎn)染48小時后的293T細胞經(jīng)過同方法1.2.5的抗體染色后進行流式細胞術(shù)檢測，結(jié)果如圖3所示：A為空白293T細胞對照，B為轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7F c-hIL12質(zhì)粒的293T細胞。從B圖可見，F(xiàn)ITC標記的細胞(表達sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI)的表達率為16.71%。

2.4瞬時轉(zhuǎn)染細胞的免疫熒光檢測 在我們構(gòu)建的 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12重組質(zhì)粒中，HPV58mE6E7基因的羧基端融合了人IgG Fc段基因，可作為檢測融合蛋白表達的標簽。用FITC標記(綠色熒光)的山羊抗人IgG抗體與轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12質(zhì)粒48小時后的293T細胞進行孵育，可檢測IRES上游插入的融合基因sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI在細胞中的表達情況。經(jīng)熒光顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染細胞有綠色熒光顯示，主要分布于細胞膜上(圖 4)，證明插入片段 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI能夠有效表達。

圖2 PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig．2 Resnicnon enzyme digestion of PVAX1-HPV58m E6E7c-hIL12

圖3 瞬時轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12的293T細胞流式細胞術(shù)檢測Fig．3 FACS analysis in transfected PVAX-HPV58mE6E7 Fc-hIL12 293T cell line

2.5hIL12的分泌表達 IRES下游的插入片段hIL12主要為分泌表達，因此，需用ELISA檢測轉(zhuǎn)染后的細胞上清了解其表達情況。按達科為有限責任公司人白介素12 ELISA檢測試劑盒說明步驟進行操作，顯色后用Bio-RAD酶標儀450 nm讀取OD值，根據(jù)標準品檢測結(jié)果繪制標準曲線，得到濃度與OD值的線性關(guān)系為y=240.2x(r2=0.978 3)，陰性對照的OD值為0.04，轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)上清的OD值平均值分別為2.489，計算得到hIL12的濃度分別為597.86 pg/ml，陰性對照的濃度為9.60 pg/ml，見圖5。

圖4 瞬時轉(zhuǎn)染PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12的293T細胞免疫熒光檢測(物鏡，×40)Fig．4 Immunofluorescence assay in transfected PVAX1-HPV58mE6E7c-hIL12 293T cell line FITC(Objective，×40)

圖5 hIL12分泌表達ELISA檢測結(jié)果Fig．5 ELISA showing expression of hIL12

3 討論

DNA疫苗是近年來出現(xiàn)的一種針對惡性腫瘤的新型治療方法，它將編碼特異性抗原的基因片段插入到真核表達載體中，通過一定的途徑進入人體后，即被宿主細胞攝取，并轉(zhuǎn)錄和翻譯出目的抗原多肽或蛋白，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答［3］。由于DNA疫苗既具有重組亞單位疫苗的安全性又可以像減毒活疫苗那樣誘導全譜性免疫應(yīng)答，包括產(chǎn)生特異性抗體、CD4+Th和CD8+CTL免疫應(yīng)答，因此目前已經(jīng)成為腫瘤免疫治療中極具吸引力的疫苗類型。近年來，大量研究表明HPV感染是宮頸癌及癌前病變發(fā)生的重要因素，90%以上的宮頸癌患者中可檢測到HPV DNA的存在。由于HPV病毒本身可引起機體較強的免疫反應(yīng)，因此，在宮頸癌及癌前病變的防治中，除傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等手段外，免疫治療也越來越受到重視。目前，預防性HPV疫苗的研究方面已取得較好進展，由德國Merk公司研制的HPV6/11/16/18四聯(lián)疫苗已經(jīng)上市，并在預防HPV感染上取得較好效果。而治療性HPV疫苗的療效欠佳，尚需做進一步研究。選擇恰當?shù)闹委煱悬c是構(gòu)建DNA疫苗的一個關(guān)鍵之處。由于HPV E6、E7基因的強抗原性，因此目前仍是研制HPV感染相關(guān)宮頸癌及癌前病變治療性DNA疫苗的理想靶抗原。

本實驗構(gòu)建的PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12復合DNA疫苗載體，利用雙順反子表達元件IRES的連接，在表達上游的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的同時，還能表達下游的分子佐劑hIL-12，二者具有協(xié)同免疫作用。其中，IRES上游的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合抗原片段分子量較單獨的E6或E7抗原變大，因此所得抗原蛋白的結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。并且，與HPV58mE6E7抗原融合表達的人IgG Fc段能與免疫效應(yīng)細胞表面的Fcγ受體結(jié)合進而激活它們，增強抗原呈遞功能，發(fā)揮其調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用以及激活吞噬細胞的作用等，同時還可以延長重組蛋白的半衰期，提高疫苗的療效［4］;同時帶有 Fc段的嵌合蛋白，還可以將Fc段作為檢測標簽，對該蛋白質(zhì)的鑒定和純化帶來了很大的方便，特別是在沒有HPV58E6、E7蛋白商業(yè)化抗體的情況下優(yōu)勢更為明顯。GPI錨定蛋白是一類通過其羧基末端的糖基化磷脂酰肌(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)結(jié)構(gòu)錨定于真核細胞膜表面的蛋白。完整的GPI分子轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后能與新生蛋白連接形成GPI錨定蛋白，當它與細胞共同孵育時，可自動整合至細胞膜表面，并可保持其生物學活性［5］。本研究利用GPI的目的，就是要將表達的腫瘤抗原錨定在細胞膜上，從而達到增強免疫識別的作用。因為目前的研究表明，以膜形式表達的抗原要比分泌形式表達的抗原，在激發(fā)細胞免疫反應(yīng)的能力上有更大優(yōu)勢。hIL12是構(gòu)建腫瘤DNA疫苗中常用的分子佐劑，hIL12既可促進NK細胞和細胞毒T細胞增殖和活化，直接殺傷腫瘤細胞，還能分泌GM-CSF、IL2、TNF-α等多種細胞因子，間接增強免疫［6，7］。

總之，本研究成功構(gòu)建并表達了 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-HIL12復合DNA疫苗載體，該疫苗載體通過錨定蛋白GPI將抗原HPV58mE6E7錨定在細胞表面，有利于增強抗原遞呈;同時發(fā)揮了人IgG Fc段免疫黏附素、hIL12加強免疫調(diào)節(jié)的作用?？勺鳛镠PV58陽性相關(guān)腫瘤及其癌前病變免疫治療的候選疫苗載體。

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