李 艷 趙旭東 (重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶401331)

癲癇的特點是腦部有持續(xù)存在的癲癇反復發(fā)作的易感性以及由于這種疾病引起的神經(jīng)生化、認知、心理和社會后果。目前，癲癇發(fā)病機制尚不清楚。研究表明［1，2］，炎性反應可以激發(fā)大量炎癥因子釋放，擾亂神經(jīng)通路，影響神經(jīng)傳導，對于癲癇發(fā)作的持續(xù)存在是必需的。然而，癲癇患者炎癥反應發(fā)病機制尚不清楚。近年來，越來越多研究表明，轉錄因子活化蛋白-1(Transcription factor activator protein-1，AP-1)激活是細胞炎癥反應關鍵轉錄因子［3，4］，其表達異?？梢饑乐匮装Y反應，擾亂神經(jīng)通路，影響神經(jīng)傳導，損傷組織，進一步引發(fā)各種神經(jīng)病理癥狀。故推測，AP-1可能通過炎癥反應在癲癇發(fā)病中發(fā)揮一定作用。鑒于KA所誘導的小鼠癲癇模型在病理學和行為學上的相似性，并且伴隨著海馬錐體神經(jīng)元的損傷等特點，因此成為研究人類癲癇的理想動物模型［5］。本實驗觀察了海人酸(Kainic acid，KA)側腦室注射誘導的癲癇(Epilepsy，EP)小鼠海馬AP-1表達，以探索AP-1異常表達在癲癇發(fā)病機制中所起作用。

1 材料與方法

1.1材料 C57小鼠(32只)，飼養(yǎng)條件：溫暖(20℃)，避強光、避噪音，單籠自由進食和飲水。按照完全隨機數(shù)字表法將實驗動物分成模型組(24只)和對照組(8只)，模型組再按照不同處死時間分為造模后3、8、24小時，每組8只。海人酸(Kain-ic acid，KA;Sigma公司)，兔抗小鼠AP-1抗體(Santa Cruz公司)，生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司，武漢)，腦立體定向注射儀(深圳瑞沃德公司)。

1.2方法

1.2.1建立小鼠癲癇模型 模型組小鼠側腦室注射KA，分別于術后3、8、24小時觀察。以3.6%水合氯醛360 mg/kg腹腔注射將小鼠麻醉后，將其頭部固定在立體定向儀上，常規(guī)備皮、消毒，沿頭部正中線切開頭皮、暴露前囟。根據(jù)小鼠腦立體定向圖譜定位側腦室(前囟后0.4 mm，右側旁開1.3 mm)，鉆直徑為1.0 mm的一個圓孔，深度達硬腦膜表面，注意盡量不傷及腦組織。將預先裝有KA的微量進樣器沿鉆孔進針，深度達1.7 mm時向側腦室內(nèi)緩慢注射1 μg/μl KA溶液1 μl(10分鐘內(nèi)勻速注射完畢)，留針5分鐘后拔除穿刺針，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進行行為學觀察。按照Racine分級［5］判斷癲癇發(fā)作程度，Ⅲ級以上為成功動物模型。如果造模失敗，則用相同數(shù)量動物補充造模。對照組用等體積生理鹽水代替KA行側腦室注射。

1.2.2RT-PCR檢測AP-1 mRNA轉錄水平 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。用Trizol法(Trizol試劑盒，天根公司)按說明書提取總RNA?？俁NA純度和濃度使用紫外分光光度計(NanoPhotometer，Germany)測定，經(jīng)測定所用樣品的A260/A280比值都在1.8～2.0之間。反轉錄過程也按試劑說明書進行操作。應用Prime premier 5.0軟件設計AP-1和內(nèi)參GAPDH基因引物。引物由上海英駿生物公司合成。引物序列如下：AP-1上游引物為 5＇CCCACCCAGTTCTTGTGCC3＇;AP-1 下游引物為5＇TGTTCTGGCTATGCAGTTCAGC3＇;擴增片段為97 bp，GAPDH上游引物為5＇GCATTGTGGAAGGGCTCA3＇;GAPDH上游引物為5＇AAGGTGGAAGAGTGGGAGT3＇;擴增片段為 379 bp。

PCR循環(huán)條件為：94℃ 預變性2分鐘，94℃ 變性30秒，60℃退火30秒，72℃ 延伸2分鐘，35個循環(huán)后于72℃ 延伸10分鐘。PCR反應產(chǎn)物的大小分別為97 bp(AP-1)和379 bp(GAPDH)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，gold view染色。使用紫外光凝膠照像，經(jīng)Image軟件進行灰度測定，實驗重復3次。將AP-1的灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

1.2.3Western blot檢測AP-1蛋白表達情況 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦，分離海馬組織。將沖洗干凈的海馬組織置于含有2 ml蛋白提取緩沖液、蛋白酶抑制劑cocktail(Roche)的2 ml的勻漿器中，研磨，收集研出液。冰水混合物孵育10分鐘后，4℃、12 000 r/min離心10分鐘，取上清分裝，-80℃保存。將蛋白樣本與5×SDS上樣液混合后，100℃煮沸5分鐘，加入上樣孔，130 V恒壓電泳約2小時，PVDF膜轉膜100 mA，30分鐘、5%脫脂奶粉封閉37℃，1小時，加入兔抗小鼠AP-1抗體(1∶1 000)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)，37℃、1小時。TBST充分洗滌后，用化學發(fā)光試劑盒(Thermo)進行曝光。使用Bio-rad發(fā)光成像儀分析與采集發(fā)光信號強度。

1.2.4免疫組化檢測AP-1在海馬表達水平 分別于術后3、8、24小時對麻醉后小鼠斷頭取腦。用4%多聚甲醛緩沖液固定后，進行石蠟包埋，在視交叉前端大腦和背側海馬處連續(xù)切片，切片厚4 μm。先用檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)，在高壓鍋內(nèi)進行抗原熱修復，進行免疫組織化學染色一抗是兔抗小鼠AP-1抗體單克隆抗體(Santa cruz)，使用生物素化山羊抗兔二抗(博士德公司)，室溫孵育10分鐘;滴加辣根酶室溫孵育20分鐘;DAB顯色，室溫5分鐘，顯微鏡觀察顯色效果。染色結果判斷標準采用選擇相同區(qū)域、相同條件下用image進行光密度分析。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，依據(jù)實驗數(shù)據(jù)類型作方差分析和相關分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1小鼠行為學觀察結果 模型組小鼠在KA側腦室注射3小時后出現(xiàn)明顯反復發(fā)作的咀嚼、面部抽搐、肢體陣攣、身體背曲、尾部翹起、陣發(fā)性旋轉、站立跌倒、后退等癲癇發(fā)作癥狀。每次發(fā)作數(shù)秒至10余秒，反復間歇性發(fā)作數(shù)小時，8小時后逐漸恢復到正常狀態(tài)，24小時仍有發(fā)作，以Ⅱ～Ⅲ級發(fā)作為主。對照組小鼠無上述癇樣發(fā)作。

2.2癲癇發(fā)作小鼠及對照組各時間RT-PCR檢測AP-1 mRNA轉錄水平 應用PCR進一步證實AP-1在術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬組織中的轉錄強度。圖1顯示，AP-1條帶位于97 bp左右，與預期產(chǎn)物大小保持一致。術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達皆上升(P＜0.05)，其中術后8h時表達最高(P＜0.01)，術后24小時時趨于降低，但是仍高于正常對照組(P＜0.05，見圖1)。

2.3癲癇發(fā)作小鼠及對照組各時間點Western blot檢測AP-1蛋白表達情況 應用Western blot進一步證實AP-1在術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬組織中的蛋白表達強度。圖2顯示，AP-1條帶位于43 kD左右，與預期產(chǎn)物大小保持一致。術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達皆上升(P＜0.05)，其中術后8小時時表達最高(P＜0.01)，術后24小時時趨于降低，但是仍高于正常對照組(P＜0.05，見圖2)。

圖1 RT-PCR檢測基因AP-1在各組小鼠海馬的表達Fig．1 mRNA expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

2.4癲癇發(fā)作小鼠及對照組各時間點免疫組化檢測AP-1在海馬表達水平 應用免疫組織染色化學方法對癲癇發(fā)作小鼠及對照組各時間點AP-1在海馬表達組織可中變化進行檢測發(fā)現(xiàn)，NS組海馬極少見到棕黃色顆粒沉積，提示正常海馬細胞內(nèi)AP-1表達很少。而模型組海馬可見有大量棕黃色顆粒沉積，提示癲癇小鼠海馬AP-1表達上升。而這些表達主要集中于海馬CA1區(qū)。特別是術后8小時，海馬可見有大片棕黃色顆粒沉積，提示術后8小時，癲癇小鼠海馬AP-1表達最高。各組間細胞形態(tài)未見明顯差異。結果表明，術后3、8、24小時，癲癇小鼠海馬AP-1蛋白表達上升，術后8小時時表達最高，24小時有所下降(見圖3)。

3 討論

圖2 Western blot檢測蛋白AP-1在各組小鼠海馬的表達Fig．2 Protein expression of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

圖3 AP-1在各組小鼠海馬的免疫組化表達Fig．3 Immunohistochemistry staining of AP-1 in the hippocampal of mouse in each group

中國約有 900萬癲癇患者，其中約600萬是“活動性癲癇”患者，同時每年新增癲癇患者約40萬，癲癇患者的死亡危險性為一般人群的2～3倍［7］。盡管現(xiàn)在有很多藥物可以治療癲癇，但是目前的抗癲癇藥對1/3的患者沒有作用［8］，可見了解癲癇的發(fā)病機制是治療癲癇的根本目標。雖然癲癇的病因和發(fā)病機制至今不明，但是近十年來，越來越多的臨床和實驗證據(jù)證實，腦內(nèi)的炎癥過程可以損傷神經(jīng)細胞，影響神經(jīng)傳導，可能是癲癇發(fā)作的一個常見而有決定性的病理機制［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種細胞因子如TNF-α、IL-8、IL-6等都參與了癲癇炎癥過程［9］。Maroso 等［10］研究認為 IL-1β 和高遷移率族蛋白B1分別與IL-1R1和Toll樣受體4結合，通過級聯(lián)信號的放大作用激活轉錄因子核因子κB途徑，激活的核因子κB進入細胞核與相應靶序列結合，調(diào)節(jié)相關靶基因的轉錄活性，參與炎性反應、免疫反應、細胞凋亡等過程。這個轉錄途徑調(diào)節(jié)的相關炎性因子基因表達增強，引起海馬神經(jīng)元的損傷［11］。炎性介質(zhì)可以增加血管的通透性，使血清蛋白進入腦內(nèi)影響離子緩沖能力，增強周圍神經(jīng)興奮性和抑制膠質(zhì)細胞攝取谷氨酸，從而引起神經(jīng)元的過度興奮。進一步可引發(fā)癲癇等一系列神經(jīng)系統(tǒng)病理癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應發(fā)病機制目前尚不清楚。

研究證實，炎癥介質(zhì)大多受轉錄因子的調(diào)控，轉錄因子尤其AP-1可以調(diào)節(jié)細胞炎性因子基因表達，導致炎癥持續(xù)和發(fā)展，進而影響疾病的嚴重程度和對治療的反應［12］。AP-1是由c-fos和c-jun蛋白組成的同源或異源二聚體。靜息狀態(tài)下，AP-1的蛋白濃度和活性極低，分子結構以c-jun同源二聚體為主。當細胞受到刺激時，c-jun、c-fos表達水平增高，并轉變?yōu)橐詂-fos、c-jun異源二聚體為主的存在形式，DNA連接和誘導轉錄能力也迅速提高，促進細胞因子的轉錄合成。Bobrovnikova-Marjon等［3］用AP-1蛋白的突變形式封閉AP-1活性后，發(fā)現(xiàn)IL-8的表達明顯受到抑制。因此，AP-1表達異常可引發(fā)異常炎癥反應，從而進一步損傷神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。然而，癲癇患者中樞炎癥反應是否與AP-1表達異常相關，目前尚無相關報道。

海人酸側腦室注射可引起小鼠癲癇癥狀，為動物癲癇經(jīng)典模型。已有研究表明，海人酸(Kainic acid，KA)在PC12離體神經(jīng)細胞死亡的同時伴有AP-1表達上升［11］，而抑制其激活則可降低神經(jīng)細胞死亡［12］，這些給我們的提示，AP-1在神經(jīng)細胞神經(jīng)毒性激活情況下，可能參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。本實驗通過對KA側腦室注射引發(fā)小鼠癲癇模型海馬AP-1在術后3、8、24小時后AP1的基因和蛋白表達趨勢的觀察后發(fā)現(xiàn)，AP-1在癲癇小鼠海馬表達在術后3小時即開始明顯上升，8小時達到高峰，24小時又開始趨于下降，但仍高于對照組。說明AP-1高表達與癲癇發(fā)病間可能具有密切關系。并且分布表達變化主要以海馬CA1區(qū)為主，可能作為CA1區(qū)海馬神經(jīng)元興奮的重要炎性標志之一。但本實驗屬于觀察性實驗，尚不能說明AP-1在癲癇發(fā)病中作用，還需進一步研究。

綜上，AP-1高表達與癲癇發(fā)病間可能具有密切關系，進一步研究可能為癲癇發(fā)病機制研究提供一條新的途徑。

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