林 靜 王 磊 蘇又蘇 方紅成 李大主

(華中科技大學同濟醫(yī)學院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430022)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、T細胞和樹突狀細胞等免疫炎性細胞均參與了AS的發(fā)生和發(fā)展［1］。研究表明，巨噬細胞激活，高表達 HLADR、CD86等抗原提呈分子，分泌單核細胞趨化因子-1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等多種炎癥因子，誘導、趨化和活化其他血管炎性細胞，在放大AS炎癥反應中起重要作用［2］。胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種主要表達于上皮細胞的細胞因子，其主要生物學作用是激活樹突狀細胞，從而促進T細胞分化，在哮喘、支氣管炎和皮膚過敏等疾病的炎癥反應中發(fā)揮重要作用［3，4］。近年來研究證實氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等參與AS炎癥反應的重要刺激因子均可誘導血管炎性細胞產(chǎn)生TSLP［5，6］，但是 TSLP 對于血管炎性細胞的作用和機制目前尚不清楚。本研究通過觀察TSLP對小鼠巨噬抗原提呈能力、炎癥因子分泌功能的影響，進一步探討其在動脈粥樣硬化炎癥反應中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57B背景TSLPR基因敲除(TSLPR-/-)小鼠由美國圣朱迪兒童醫(yī)院生物化學實驗室(St.Jude Children＇s Research Hospital)James N.Ihle博士同意并授權(quán)，由瑞士國家疫苗研究所(Swiss Vaccine Research Institute)動物中心Nicola L.Harris博士饋贈;野生型C57B小鼠作為正常對照組，購自中國科學院上海實驗動物中心。所有實驗動物的操作及飼養(yǎng)均符合湖北省及同濟醫(yī)學院實驗動物管理飼養(yǎng)條例，遵循人道原則。實驗小鼠均飼養(yǎng)在清潔級環(huán)境中，統(tǒng)一喂養(yǎng)。

1.2主要試劑 小鼠重組TSLP購自RD公司;Trizol RNA提取試劑購自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶;dNTP等PCR試劑購自TaKaRa公司;PCR引物由大連寶生物公司合成;RPMI1640購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自Gibco BRL公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自eBioscience公司;PE標記的抗小鼠CD86單克隆抗體和FITC標記的抗小鼠MHCⅡ單克隆抗體購于eBioscience公司;流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1小鼠巨噬細胞的分離 各組小鼠均取5只，分離小鼠腹腔巨噬細胞。具體操作方法如下：斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡10分鐘，剖腹收集腹腔內(nèi)液，800 r/min離心5分鐘后收集細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×106細胞/ml，加入培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)4小時后去上清液，PBS洗去未貼壁細胞。

表1 RCR引物Tab．1 PCR primers

1.3.2分組及細胞共培養(yǎng) 實驗分為4組：(1)野生型對照組：C57B野生型小鼠巨噬細胞+PBS;(2)野生型實驗組：C57B野生型小鼠巨噬細胞+TSLP(50 ng/ml);(3)TSLPR-/-對照組：TSLPR-基因敲除小鼠巨噬細胞+PBS;(4)TSLPR-/-實驗組：TSLPR基因敲除小鼠巨噬細胞+TSLP(50 ng/ml)。上述各組細胞與TSLP或PBS共培養(yǎng)24小時后收獲，行后續(xù)檢測。

1.3.3流式細胞術(shù)檢測小鼠巨噬細胞抗原提呈分子MHCⅡ和CD86的表達 收集上述處理過的各組巨噬細胞，離心棄上清，用PBS洗液(包括0.1%疊氮鈉和2%BSA)洗2遍，調(diào)細胞密度至0.5×106個。取100 μl細胞懸液加入20 μl FITC-conjugated anti-CD86單克隆抗體和PE-conjugated anti-MHCⅡ單克隆抗體，PE-和FITC-conjugated的同型IgG1作對照，4℃，暗室孵育30分鐘。然后，細胞用PBS洗液洗一遍，再重懸于PBS洗液，并立即用流式細胞儀檢測。其結(jié)果以陽性百分率表示。

1.3.4實時定量PCR檢測小鼠腹腔巨噬細胞MCP-1、IL-10、TNF-αmRNA表達 按 RT-PCR 試劑盒提供方法進行，反轉(zhuǎn)錄后PCR，所用引物見表1。PCR反應條件為：94℃預變性5分鐘后，94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，循環(huán)35次再72℃延伸7分鐘。反應結(jié)束后分析熒光值變化曲線和溶解曲線。每個反應重復 3次，采用2-△△Ct算法分析結(jié)果。

1.3.5ELISA檢測上清液 MCP-1、IL-10和 TNF-α濃度 將分離的各組小鼠巨噬細胞與PBS或TSLP共培養(yǎng)24小時后，收集培養(yǎng)上清，按照小鼠MCP-1、IL-10或TNF-α試劑盒的操作步驟檢測培養(yǎng)上清中MCP-1、IL-10和TNF-α濃度。實驗設(shè)雙復孔，重復3次。

1.4統(tǒng)計學分析 以上各組實驗至少獨立重復3次，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS12.0作統(tǒng)計學處理。組間數(shù)據(jù)處理根據(jù)方差齊性分析的結(jié)果，進一步使用S-N-K檢驗，進行組間差異的比較，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1TSLP對小鼠巨噬細胞抗原提呈分子MHCⅡ和CD86影響 流式細胞術(shù)表明：與野生型對照組小鼠巨噬細胞表面MHCⅡ(4.62±1.46)%及CD86(11.60±3.67)%相比較，野生型實驗組小鼠巨噬細胞表面MHCⅡ(15.75±3.52)%(P＜0.01)及CD86(37.75±8.17)%(P＜0.001)的表達均明顯增加;與TSLPR-/-對照組小鼠巨噬細胞表面MHCⅡ(3.55±2.05)%及CD86(16.03±3.09)%相比較，TSLPR-/-實驗組小鼠巨噬細胞表面MHCⅡ(5.70±2.70)%及CD86(13.20±3.70)%的表達無明顯變化(P＞0.05);與野生型實驗組小鼠巨噬細胞表面 MHCⅡ(15.75±3.52)%及 CD86(37.75±8.17)%相比較，TSLPR-/-基因敲除能夠明顯抑制TSLP誘導的小鼠巨噬細胞抗原提呈分子MHCⅡ(5.70±2.70)%(P＜0.01)及CD86(13.20±3.70)%(P＜0.001)的表達(見圖1及表2)。

表2 TSLP對小鼠巨噬細胞抗原提呈分子MHCⅡ及CD86影響(x ± s，%)Tab．2 Effect of TSLP on MHCⅡ and CD86 expression in mice macrophages(x ± s，%)

圖1 TSLP對小鼠巨噬細胞抗原提呈分子MHCⅡ及CD86影響Fig．1 Effect of TSLP on MHCⅡ and CD86 expression in mice macrophages

2.2TSLP對小鼠巨噬細胞 MCP-1、TNF-α和 IL-10mRNA水平的影響 與野生型對照組小鼠腹腔巨噬細胞 MCP-1mRNA(1.00±0.00)和 TNF-αmRNA(1.00±0.00)相比較，野生型實驗組小鼠腹腔巨噬細胞MCP-1mRNA(2.17±0.62)(P＜0.001)和TNF-αmRNA(3.22±0.30)(P＜0.001)水平明顯上調(diào);與TSLPR-/-對照組MCP-1mRNA(1.68±0.54)和TNF-αmRNA(0.91±0.16)相比較，TSLPR-/-實驗組小鼠巨噬細胞 MCP-1mRNA(1.27±0.28)和 TNF-αmRNA(1.31±0.18)水平無明顯變化(P＞0.05);與野生型實驗組小鼠巨噬細胞MCP-1mRNA(2.17±0.62)和 TNF-αmRNA(3.22±0.30)相比較，TSLPR-/-基因敲除能夠明顯抑制TSLP誘導的小鼠巨噬細胞MCP-1mRNA(1.27±0.28)(P＜0.001)和TNF-α mRNA(1.31±0.18)(P＜0.001)表達。野生型對照組小鼠腹腔巨噬細胞IL-10mRNA(1.00±0.00);野生型實驗組小鼠腹腔巨噬細胞IL-10mRNA(1.35±0.18);TSLPR-/-對照組小鼠腹腔巨噬細胞 IL-10mRNA(1.18±0.26);TSLPR-/-實驗組小鼠腹腔巨噬細胞 IL-10mRNA(0.95±0.16)。四組間 IL-10mRNA水平無明顯變化(P＞0.05，見圖2)。

圖2 TSLP對小鼠巨噬細胞 MCP-1、TNF-α和 IL-10mRNA水平的影響(±s)Fig．2 Effect of TSLP on MCP-1，TNF-α and IL-10mRNA expression in mice macrophages(±s)

圖3 TSLP對小鼠巨噬細胞分泌MCP-1、TNF-α和IL-10的影響 (±s)Fig．3 Effect of TSLP on MCP-1，TNF-α and IL-10 production in mice macrophages(±s)

2.3TSLP對小鼠巨噬細胞分泌MCP-1、TNF-α和IL-10的影響 與野生型對照組MCP-1(67.89±9.67)pg/ml和 TNF-α(340.99 ±30.39)pg/ml相比較，野生型小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清MCP-1(825.50±42.44)pg/ml(P＜0.001)和 TNF-α(3240.39±202.13)pg/ml(P＜0.001)水平明顯增加;與TSLPR-/-對照組MCP-1(99.22±15.42)pg/ml和TNF-α(318±29.32)pg/ml相比較，TSLPR-/-實驗組小鼠巨噬細胞上清 MCP-1(105.89±7.66)pg/ml和TNF-α(285.39±34.45)pg/ml水平無明顯變化(P＞0.05);與野生型實驗組小鼠巨噬細胞培養(yǎng)上清MCP-1(825.50±42.44)pg/ml和TNF-α(3 240.39±202.13)pg/ml相比較，TSLPR-/-基因敲除能夠明顯抑制TSLP誘導的小鼠巨噬細胞MCP-1(105.89±7.66)pg/ml(P＜0.001)和 TNF-α(285.39±34.45)pg/ml(P＜0.001)分泌。野生型對照組上清IL-10水平(42.88±8.02)pg/ml;野生對照組巨噬細胞培養(yǎng)上清IL-10(107.72±10.150)pg/ml;TSLPR-/-對照組小鼠巨噬細胞上清IL-10(88.61±6.81)pg/ml;TSLPR-/-實驗組小鼠巨噬細胞上清IL-10(80.28±5.67)pg/ml。四組間上清IL-10分泌水平無明顯變化(P＞0.05，見圖3)。

3 討論

TSLP是近年來發(fā)現(xiàn)的一個類IL-7細胞因子，其是樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)的最特異和最強效的活化因子。TSLP主要表達于上皮細胞、皮膚角質(zhì)細胞和支氣管平滑肌細胞，正常血管細胞并不表達TSLP。吸煙、機械損傷、致敏原以及微生物可誘導上皮細胞，皮膚角質(zhì)細胞和支氣管平滑肌細胞等高度表達TSLP，在受損組織局部活化DC，促進初始T細胞向效應T細胞轉(zhuǎn)變，從而啟動哮喘、支氣管炎和皮膚過敏等疾病的炎癥反應［3，4，7，8］，被譽為炎癥反應的“總開關(guān)”。

近期研究表明，TSLP可能參與了動脈粥樣硬化炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。急性動脈綜合征患者循環(huán)血中TSLP水平升高［9］;體外研究我們發(fā)現(xiàn)：正常未經(jīng)刺激的血管內(nèi)皮細胞幾乎不表達TSLP，但經(jīng)ox-LDL刺激后，血管內(nèi)皮細胞可大量表達 TSLP［5］。參與AS炎癥反應的重要促炎因子AngⅡ可通過激活NF-κB途徑刺激血管平滑肌細胞表達TSLP［6］。以上研究提示TSLP可能參與了AS炎癥反應，但是其在AS炎癥反應中的具體作用和機制目前尚不清楚。

參與AS炎癥反應的巨噬細胞可分化成經(jīng)典活化型(Classically activated，M1型)和替代活化型(Alternatively activated，M2型)兩類。既往研究表明，IL-4及IL-13等可誘導產(chǎn)生M2型巨噬細胞，表現(xiàn)為較低的抗原提呈能力(MHCⅡ表達降低)，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β等下調(diào)AS炎癥反應［10］;細菌或其產(chǎn)物脂多糖(LPS)的誘導產(chǎn)生M1型巨噬細胞，表現(xiàn)為具有較強的抗原提呈能力(MHCⅡ表達增高)產(chǎn)生一氧化氮(NO)及活性氧中間產(chǎn)物(Reactive oxygen intermediates，ROS)并通過分泌IL-12和IL-23誘導其它炎癥因子如TNF-α，MCP-1產(chǎn)生促進和放大 AS炎癥反應［11，12］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予TSLP刺激可以促進巨噬細胞活化，增強其表面抗原提呈分子表達，促使小鼠巨噬細胞分泌炎癥因子TNF-α和MCP-1，而對抑炎因子IL-10無明顯影響。以上研究表明TSLP刺激可使巨噬細胞向促炎表型的M1巨噬細胞分化，此作用可能是TSLP參與AS炎癥反應的機制之一。本研究還發(fā)現(xiàn)胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素受體(Thymic stromal lymphopoietin receptor，TSLPR)基因敲除可抑制TSLP對小鼠巨噬細胞抗原提呈分子及炎性因子分泌功能的影響，提示TSLP是通過與巨噬細胞表面受體TSLPR結(jié)合介導了小鼠巨噬細胞向促炎表型M1型分化功能。

綜上所述，TSLP可通過與TSLPR結(jié)合促進小鼠巨噬細胞活化，增強小鼠巨噬細胞表面抗原提呈分子表達，分泌促炎因子，促使小鼠巨噬細胞向促炎表型M1型轉(zhuǎn)化，此作用可能為TSLP參與AS炎癥反應作用機制之一，上述發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明TSLP在炎癥反應中的作用機制，還有助于為進一步研究TSLP在AS炎癥反應中的作用和機制提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

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