賈曉暉 賈天軍 李 萍 (河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，張家口07500)

肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，Cpn)是一個廣泛流行的呼吸系統(tǒng)病原體，為嚴格細胞內(nèi)寄生菌，可導(dǎo)致多種疾病，最常見的是衣原體性肺炎、支氣管炎和哮喘［1］。肺炎衣原體與慢性肺部疾病相關(guān)，也可能與形成主動脈/冠狀動脈粥樣硬化、腦血管疾病、肺癌以及結(jié)節(jié)性紅斑等疾病有關(guān)，日益受到人們的關(guān)注［2-5］。Cpn分離培養(yǎng)較困難，從而影響深入研究其致病機制、特異性診斷和疫苗的開發(fā)。

包涵體是衣原體賴以生存和繁殖的微環(huán)境，包涵體膜蛋白(Inclusion membrane proteins，Inc)是衣原體基因編碼、表達定位于包涵體膜上的蛋白質(zhì)，僅在感染期間表達的、專門定位于包涵體膜上的衣原體特有的蛋白質(zhì)，已有的研究初步顯示包涵體膜蛋白在包涵體內(nèi)衣原體復(fù)制、營養(yǎng)攝取及信號轉(zhuǎn)換等方面發(fā)揮重要作用，并且在感染人群中表現(xiàn)出一定的免疫原性，這對進一步探討包涵體膜蛋白的生物學(xué)、了解衣原體致病機制以及衣原體感染的預(yù)防提供新的途徑［6-8］。CpnAR39全基因組長1 222 853 nt，包含1 167個基因。本研究選擇 CpnAR39株Cpn0308基因作為研究對象，是新發(fā)現(xiàn)的包涵體膜蛋白，該基因在染色體上的占據(jù)位置為第349 243 bp到349 599 bp，基因長度為366 bp。我們實驗室已有的實驗結(jié)果證明Cpn0308定位于包涵體上［9，10］，且具有較強的免疫原性(本實驗室資料，未發(fā)表)。本實驗構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/His ACpn0308，將重組質(zhì)粒腹腔注射小鼠一定時間后觀察小鼠免疫反應(yīng)變化，期望增強小鼠對肺炎衣原體免疫防御能力，為進一步研究Cpn0308免疫保護性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和載體質(zhì)粒 CpnAR39標準株純化基因組DNA模板為美國德克薩斯大學(xué)圣安東尼奧醫(yī)學(xué)中心微生物學(xué)系鐘光明教授惠贈;HeLa細胞、工程菌E．coli XL1-Blue、真核表達載體pcDNA3.1/His A為本研究所保存。

1.1.2主要試劑 Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ(50 U/μl)、NotⅠ(10 U/μl)、EcoR V(15 U/μl)、dNTP(2.5 mol/L)、IPTG 購于大連TaKaRa公司;DNA Marker購于南京金思瑞生物科技有限公司;低分子量預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker購于南京凱基生物;PVDF膜購于Millipore公司。

1.1.3抗體 Cpn0308多克隆抗體為本實驗室制備并保存;辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體購于南京金思瑞生物科技有限公司;異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG抗體購于Solarbio公司;小鼠IL-4、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購于江蘇希望生物制品有限公司。

1.1.4實驗用小鼠 雌性BALB/c小鼠30只，4～5周，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，編號：0170779。

1.2實驗方法

1.2.1真核表達重組載體構(gòu)建與鑒定 根據(jù)GeneBank提供的CpnAR39株Cpn0308基因序列(AE001363)，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計一對引物，P1：5＇-CGCGGATCCATGGCTACAGTAGCACAAACA-3＇，劃線部分為 BamH Ⅰ酶切位點;P2：5＇-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTATTTAGAGGAGTAACGAT-3＇，劃線部分為NotⅠ酶切位點。經(jīng)過PCR擴增得到目的基因，然后分別對PCR擴增產(chǎn)物和pcDNA3.1/His A質(zhì)粒行BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，混合 BamHⅠ/NotⅠ處理后的 PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1/His A酶切產(chǎn)物，加入連接酶，16℃過夜。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E．coli XL1-blue，接種到LB固體選擇性培養(yǎng)基(含Ampicillin，100 μg/ml)37℃過夜，做菌落PCR初步篩選陽性克隆。從陽性克隆培養(yǎng)物中提取重組質(zhì)粒，行PCR、EcoR V單酶切(Cpn0308基因中含有EcoR V限制性內(nèi)切酶酶切位點)和雙酶切，驗證重組質(zhì)粒準確性;取部分質(zhì)粒送由公司進行序列測定。測序結(jié)果驗證正確后得到陽性真核表達重組體pcDNA3.1/His ACpn0308，試劑盒大量提取質(zhì)粒備用。

1.2.2pcDNA3.1/His A-Cpn0308在真核細胞內(nèi)表達 嚴格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，同時以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1/His A的細胞做陰性對照。將轉(zhuǎn)染后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后的轉(zhuǎn)染細胞取出，進行間接免疫熒光檢測，立即熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3對小鼠免疫功能影響

1.2.3.1動物免疫 實驗用BALB/c小鼠穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，按完全隨機方式將小鼠分為pcDNA3.1/His A-Cpn0308重組質(zhì)粒組，pcDNA3.1/His A質(zhì)粒組，PBS對照組，共3組，每組10只。將大量提取的pcDNA3.1/His A-Cpn0308重組質(zhì)粒及pcDNA3.1/His A質(zhì)粒用無菌PBS稀釋為1 μg/ml，采用腹腔注射方法分別免疫各組小鼠，每種質(zhì)粒用量為100 μg，并與第0、14和28天進行3次免疫，注意無菌操作。末次免疫后2周，處死小鼠取全血，離心分離、保存血清，檢測抗體及細胞因子。

1.2.3.2抗體水平檢測 應(yīng)用間接ELISA方法檢測血清抗體水平。ELISA板為本實驗室自己制備，所包被抗原為原核表達的Cpn0308蛋白(包被濃度10 μg/ml)，經(jīng)預(yù)實驗證實與無關(guān)血清無交叉反應(yīng)且敏感性較高。用于檢測不同組別小鼠體內(nèi)Cpn0308蛋白IgG抗體水平。

1.2.3.3Western blot檢測抗體特異性 應(yīng)用Western blot方法檢測小鼠血清中Cpn0308蛋白抗體特異性，具體方法參照文獻［11］。

1.2.3.4細胞因子水平檢測 ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平，嚴格按照說明書進行操作，再根據(jù)樣品的A450值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣本濃度，記錄數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理與分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 用SPSS17.0軟件包，采用Student t test對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1真核表達重組載體構(gòu)建與鑒定 pcDNA3.1/His A-Cpn0308重組質(zhì)粒用引物 P1，P2擴增出約400 bp左右的條帶;重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，可切出2個片段，大小與預(yù)期結(jié)果相吻合;經(jīng)BamHⅠ單酶切后位置較雙酶切第二條帶靠上;對 pcDNA3.1/His A-Cpn0308 PCR產(chǎn)物進行EcoR V限制性內(nèi)切后，出現(xiàn)兩條帶，分子量大小分別為81 bp和312 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，結(jié)果顯示(見圖1)。序列分析證實，測序結(jié)果與GeneBank登錄的肺炎衣原體AR39株Cpn0308基因堿基序列完全一致，且密碼子讀碼框架正確，基因片段全長366 bp，編碼121個氨基酸，該登錄序列號為AE001363，對比結(jié)果如下，測序圖略。

2.2真核細胞內(nèi)表達檢測 在熒光顯微鏡下，pcDNA3.1/His A-Cpn0308重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，用藍光激發(fā)可見細胞胞漿內(nèi)有較強的黃綠色熒光，用紫外光激發(fā)，可見細胞核呈藍色;空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞用藍光激發(fā)細胞內(nèi)無著色，用紫外光激發(fā)可見細胞核呈藍色，結(jié)果顯示(見圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig．1 Identification of recombinant plasmid

2.3小鼠免疫結(jié)果

2.3.1血清中Cpn0308抗體水平檢測 ELISA檢測血清中Cpn0308 IgG抗體水平，pcDNA3.1/His ACpn0308重組質(zhì)粒免疫組、pcDNA3.1/His A質(zhì)粒對照組與PBS對照組血清抗體A450結(jié)果顯示(見表1)。2.3.2抗體特異性檢測 WB檢測血清中Cpn0308抗體特異性，在39 kD處pcDNA3.1/His A-Cpn0308重組質(zhì)粒組出現(xiàn)條帶，pcDNA3.1/His A質(zhì)粒對照組與PBS對照組無，結(jié)果顯示見圖3。

2.3.3血清中細胞因子檢測 末次免疫2周后取血，ELISA檢測血清中IFN-γ和IL-4含量，檢測結(jié)果如表2。pcDNA3.1/His A-Cpn0308質(zhì)粒組與pcDNA3.1/His A質(zhì)粒對照組、PBS對照組之間差異極顯著(P＜0.01)，空質(zhì)粒對照組和PBS對照組之間差異不顯著(P＞0.05)，結(jié)果顯示見表2。

圖2 細胞內(nèi)Cpn0308表達情況檢測結(jié)果Fig．2 Assay results of Cpn0308 expression in cells

圖3 Cpn0308特異性抗體WB檢測結(jié)果Fig．3 WB analysis of the specificity of antibody to Cpn0308

表1 不同組別小鼠血清IgG抗體檢測結(jié)果Tab．1 A450values of the serum IgG antibody in different groups

表2 不同組別小鼠血清中細胞因子檢測結(jié)果Tab．2 A450values of the serum cytokines in different groups

3 討論

Cpn對人類健康構(gòu)成極大的威脅，近年來Cpn感染呈上升趨勢，且多以隱性、持續(xù)性感染形式存在，造成進行性、不可逆性的病理變化，引起各種嚴重而難于治療的并發(fā)癥［12］，然而其確切的致病機制還不清楚。由于包涵體膜蛋白作用的特殊性，使其成為疫苗研制的靶蛋白，包涵體膜蛋白基因成為構(gòu)建Cpn DNA疫苗的候選基因。Cpn0308基因是預(yù)測出的一種編碼 Cpn包涵體膜蛋白基因［9，10］，本實驗室已經(jīng)成功構(gòu)建Cpn0308原核表達載體并在大腸桿菌 E．coli XL1-blue中得到高效表達，經(jīng)間接ELISA法分析其免疫原性得知Cpn0308蛋白有較強的免疫原性，因此Cpn0308蛋白成為疫苗研制的侯選蛋白，Cpn0308基因就成為構(gòu)建Cpn DNA疫苗的可能候選基因。

本實驗依據(jù)基因庫提供的基因序列設(shè)計引物，從CpnAR39基因組中擴增出Cpn0308基因，核苷酸序列測序證實與GeneBank登錄的核苷酸序列一致，選擇雙酶切方法使目的基因定向插入到pcDNA3.1/His A載體中，構(gòu)建了表達重組體pcDNA3.1/His ACpn0308。連接成功后通過質(zhì)粒雙酶切、質(zhì)粒PCR、質(zhì)粒序列測定等不同的方法對重組體進行確定，證實克隆到載體中目的基因序列的正確性。

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物細胞有多種方法，最常用的方法有：脂質(zhì)體法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法等。脂質(zhì)體是由一種脂質(zhì)雙分子層形成的微囊結(jié)構(gòu)可以將外源DNA包裹在其中，并且一起轉(zhuǎn)入細胞。同時脂質(zhì)體幾乎不具通透性，可以保護包裹在其中的DNA免受核酸酶的降解。本實驗就選擇陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并應(yīng)用間接免疫熒光法，在熒光顯微鏡下直接觀察細胞內(nèi)目的蛋白表達情況。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃綠色熒光，而空質(zhì)粒組和空細胞對照組胞漿無熒光出現(xiàn)，說明構(gòu)建的pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表達載體在體外真核細胞中得到了表達。

質(zhì)粒DNA接種的方法對免疫保護性效果有很大影響，本實驗選擇腹腔注射方式對小鼠進行基因免疫，結(jié)果顯示實驗組小鼠血清中Cpn0308總IgG抗體水平明顯升高，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異;實驗組小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平與對照組相比明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。體液免疫和細胞免疫反應(yīng)是核酸疫苗誘導(dǎo)機體抵抗病原攻擊的主要機制［13］，本實驗中IgG抗體和細胞因子的提高表明實驗組小鼠與對照組小鼠相比免疫功能增強，說明本實驗構(gòu)建的pcDNA3.1/His A-Cpn0308真核表達載體有可能增強小鼠的免疫功能，可能對肺炎衣原體感染具有抵抗能力，我們的后續(xù)實驗將從病原體攻擊等方面進一步驗證這一推斷。

盡管已經(jīng)明確Cpn是人體一種重要的致病菌，但國內(nèi)外近年來關(guān)于Cpn的研究多局限于分析Cpn與多種疾病的相關(guān)性，而在肺炎衣原體預(yù)防和診斷方面進展并不多。疫苗被認為是預(yù)防衣原體感染最好的方法，但是疫苗候選的篩選方法并不完善，至今為止仍沒有有效的Cpn蛋白疫苗和DNA疫苗應(yīng)用于臨床。隨著DNA疫苗研究的不斷深入，將會有更多更有效的肺炎衣原體DNA疫苗的方法被發(fā)現(xiàn)，使這種最簡單直接的基因療法能及早應(yīng)用和服務(wù)于人類的健康事業(yè)。

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