董江濤 徐 芳 田璽擇 姚 楠 吳 芳 章 樂 王遠(yuǎn)志 曹旭東 張萬江

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室/石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，主要被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，未被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的結(jié)核分枝桿菌，主要在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖［1］。因此對(duì)不同毒力的結(jié)核桿菌感染的不同時(shí)期機(jī)體免疫細(xì)胞凋亡率的研究，可為深入了解結(jié)核病的免疫發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，6～8周齡，體重(18±2)克，雌雄各半，共80只，購自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 菌株 結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Biovision公司)、流式細(xì)胞儀 、生物安全柜、激光共聚焦顯微鏡、Mycobacterium tuberculosis 16 kD antibody(只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)、FITC熒光二抗(山羊抗小鼠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv菌株組和卡介苗菌株組，每組按感染模型復(fù)制成功后 1、3、5、7、9、11、13、15天設(shè)置8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各設(shè)5只小鼠，每種菌株組為40只小鼠。

1.5 小鼠感染模型建立及鑒定 在生物安全柜內(nèi)，以滅菌接種環(huán)取改良羅氏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2～3周狀態(tài)良好的結(jié)核分枝桿菌菌落，置滅菌磨菌器中，加少量0.05%Tween-20的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)細(xì)菌濃度約1.0×107個(gè)/ml。將不同菌懸液經(jīng)小鼠尾靜脈分別注射到對(duì)應(yīng)分組的每只小鼠體內(nèi)，注射量約為0.3 ml。感染小鼠置生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。

1.6 小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的收集 方法參照文獻(xiàn)［2］并加以改進(jìn)，在上述不同時(shí)間點(diǎn)，將小鼠脫頸處死，經(jīng)眼后放血，暴露支氣管，用消毒好的剪刀在氣管上做一切口(切勿剪斷)，用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管，絲線固定，用4℃預(yù)冷PBS液行氣管肺泡灌洗，每次1 ml，共10次，離心管收集支氣管肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min離心10分鐘，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，貼壁細(xì)胞即為小鼠肺泡巨噬細(xì)胞。

1.7 激光共聚焦顯微鏡觀察各組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞

1.7.1 細(xì)胞爬片 收集小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞懸液均勻鋪到六孔板(內(nèi)置預(yù)先滅菌處理過的蓋玻片)中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)。

1.7.2 細(xì)胞固定 取出蓋玻片，用PBS侵洗，然后放入4%多聚甲醛固定液中室溫下靜置固定15分鐘，蒸餾水沖洗3次。

1.7.3 固定好的細(xì)胞玻片放入濕盒中，滴加山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體，勿沖洗。

1.7.4 滴加稀釋后的一抗(稀釋度1∶1 500)，均勻鋪在玻片上，濕盒內(nèi)放置，4℃過夜。

1.7.5 PBS沖洗3分鐘，3次，滴加熒光二抗(稀釋度1∶500)，室溫2小時(shí)，PBS沖洗干凈，硝酸甘油封片。

1.7.6 激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度及著色部位。

1.8 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組、各時(shí)間點(diǎn)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的說明操作：按上述方法獲得細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)4小時(shí)的貼壁小鼠肺泡巨噬細(xì)胞，倒掉上清液，加入PBS洗滌一次，用胰酶消化使貼壁細(xì)胞懸浮，1 000 r/min離心10分鐘，棄培養(yǎng)基。用500 μl 1×Binding Buffer懸浮肺泡巨噬細(xì)胞。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于2℃ ～8℃避光條件下孵育15分鐘。加入10 μl PI后輕輕混勻于2℃ ～8℃避光條件下孵育5分鐘。在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察各組感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞 感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌膜上的小分子熱休克蛋白Hsp16.3與一抗(只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)結(jié)合，再與FITC(綠色熒光)標(biāo)記二抗結(jié)合。在激光共聚焦顯微鏡下，結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)均可見大量綠色熒光(見圖1和圖2)，表明結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株被小鼠肺泡巨噬細(xì)胞大量吞噬。

2.2 利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) 結(jié)核分枝桿菌H37RV株和BCG菌株分別感染小鼠后，各感染組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡結(jié)果見圖3，H37Rv和BCG菌株感染組均出現(xiàn)巨噬細(xì)胞的凋亡率逐漸升高至第9天時(shí)達(dá)到最大的變化趨勢(shì)，見表1。

圖1 BCG菌株感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果(×400)Fig．1 BCG strains of mice infected identification copied，and extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

圖2 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果(×400)Fig．2 Infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strains of mice identification copied，extracted mouse alveolar macrophages in the co focal microscope morphology(×400)

圖3 結(jié)核分枝桿菌H37Rv和BCG菌株分別感染小鼠肺泡巨噬不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果圖Fig．3 The results of flow cytometry detecting mouse alveolar macrophages infected by M．tuberculosis H37Rv and BCG strain at different time points

表1 H37Rv組和BCG組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

表1 H37Rv組和BCG組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡率(n=5，%，±s)Tab．1 The apoptosis rate of Mouse alveolar macrophages at different time，in group H37Rv and BCG(n=5，%，±s)

Time(d)H37Rv group BCG group 1 1.68±0.28 0.60±0.09 3 6.46±0.39 0.84±0.22 5 7.19±0.34 1.63±0.97 7 12.80±0.56 1.49±0.77 9 17.41±0.68 2.49±0.72 11 12.61±1.53 1.13±0.99 13 3.38±1.28 1.16±0.28 15 2.23±0.18 0.57±0.12

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一種世界性傳染病，也是單一致病菌感染導(dǎo)致死亡率最高的感染性疾病。結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細(xì)胞等宿主免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖，但目前機(jī)體抗結(jié)核的免疫機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的探索和研究。

結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白(sHSPs，small heat shock proteins)HSP16.3是近年研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌中一個(gè)存在于膜上的主要抗原蛋白，一個(gè)組成性表達(dá)蛋白，正常條件下有少量表達(dá)，在結(jié)核分枝桿菌被宿主巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期時(shí)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16.3顯著表達(dá)［3］，本實(shí)驗(yàn)首先通過感染小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌膜上的小分子熱休克蛋白HSP16.3與一抗(只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的16 kD的小鼠單克隆抗體)特異性結(jié)合，再與FITC(綠色熒光)標(biāo)記二抗結(jié)合，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)均有大量綠色熒光，證明H37Rv菌株和BCG菌株通過尾靜脈進(jìn)入小鼠體內(nèi)可被肺泡巨噬細(xì)胞大量吞噬。然后通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)核桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒力株H37Rv感染組和BCG感染組的巨噬細(xì)胞凋亡率，均呈現(xiàn)出1～9天內(nèi)的逐漸升高，至9天時(shí)最高，分別為17.41%和2.49%，9天以后，凋亡率逐漸降低的趨勢(shì)，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv株感染組巨噬細(xì)胞的凋亡率明顯高于 BCG感染組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見，結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，主要被宿主巨噬細(xì)胞吞噬，未被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除而潛伏下來的結(jié)核分枝桿菌，也主要寄生于宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)。宿主巨噬細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌與宿主相互作用的過程中具有重要作用，結(jié)核分枝桿菌感染的后果以及結(jié)核病的發(fā)生與否與宿主巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。宿主巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡后，可殺死寄生于其內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，阻止結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的播散，并能激活鄰近未感染的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力。因此，巨噬細(xì)胞的凋亡情況對(duì)于寄生于其中的結(jié)核分枝桿菌的命運(yùn)至關(guān)重要。結(jié)核分枝桿菌要想成功地在宿主巨噬細(xì)胞中存活，就必須通過某些機(jī)制對(duì)宿主巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控，這有待于進(jìn)一步探討和研究。

在結(jié)核分枝桿菌感染的過程中，結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞相互作用及相互適應(yīng)，可調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的凋亡。目前關(guān)于結(jié)核分枝桿菌干預(yù)和調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡的途徑和機(jī)制尚不清楚，在結(jié)核菌感染的早期巨噬細(xì)胞凋亡率不高，可能是由于巨噬細(xì)胞大量地凋亡將不利于巨噬細(xì)胞提呈抗原，機(jī)體主要通過這段時(shí)間建立有效的抗結(jié)核細(xì)胞免疫效應(yīng)。隨著機(jī)體免疫效應(yīng)的建立，巨噬細(xì)胞通過自身的凋亡達(dá)到殺死和清除結(jié)核分枝桿菌的目的，結(jié)核菌感染宿主巨噬細(xì)胞凋亡率逐漸升高，最終達(dá)到頂峰［4］。結(jié)核分枝桿菌可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也具有抑制巨噬細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)這兩種作用達(dá)到平衡時(shí)，結(jié)核分枝桿菌則以休眠狀態(tài)存在于巨噬細(xì)胞中，形成所謂的“逃避”，使自身的存活、繁殖與宿主的一系列免疫反應(yīng)達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡［5］，因此，結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展過程中，時(shí)刻伴隨機(jī)體免疫細(xì)胞的凋亡是機(jī)體與結(jié)核分枝桿菌之間相互斗爭(zhēng)的結(jié)果。對(duì)結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞調(diào)控作用的機(jī)制研究，為闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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3 Fu X，Chang Z.Identification of a highly conserved pro-gly doublet in non-animal small heat shock proteins and characterization of its structural and functional roles in Mycobacterium tuberculosis Hsp16.3［J］.Biochemistry(Mosc)，2008;71(Suppl 1)：S83-S90.

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