姚茹冰 高佩芳 蔡 輝

（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

近年研究提示，環(huán)瓜氨酸肽及其相關(guān)抗原是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）發(fā)病過程中的原發(fā)致病靶抗原，在一定易感基因背景下，特定蛋白或多肽瓜氨酸化可能作為RA發(fā)病的初始抗原發(fā)揮致病作用。青藤堿用于治療RA有較好的抗炎和免疫抑制作用［1-3］。本文觀察青藤堿對(duì)環(huán)瓜氨酸肽刺激的RA患者外周血T細(xì)胞體外分泌干擾素（INF）-γ和白細(xì)胞介素（IL）-4等細(xì)胞因子的影響，以期深入了解青藤堿治療RA的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2009年5月至2009年9月本院就診的24例RA患者，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1987年RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。同時(shí)滿足以下入選條件：血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽性；近1個(gè)月內(nèi)未用過免疫抑制劑；近1個(gè)月內(nèi)未服用＞10 mg/d（按潑尼松劑量計(jì)算）的腎上腺糖皮質(zhì)激素。其中女性19例，男性5例；年齡 28～81 歲；病程 3 個(gè)月至 40 年，平均（8.7±2.6）年。

1.2 試劑與儀器 人工合成環(huán)瓜氨酸肽 （環(huán)瓜氨酸肽–HQC/HQE/STX/GRS/RGR/CGRSGS-）由上海華大天源公司合成制備，純度＞95.0%；青藤堿干粉（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；注射用MTX 5 mg/支 （上海華聯(lián)制藥）；Hyclone改良型RPMI1640培養(yǎng)基 （含25 mmol/L Hepes和2 mmol/L谷氨酰胺），Gibco公司產(chǎn)品；人外周血淋巴細(xì)胞分離液，TBD公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品；植物血凝素 （PHA），Sigma公司產(chǎn)品；IFN-γ和IL-4試劑盒為美國(guó)R&D公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品。臺(tái)式水平離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新），超凈工作臺(tái) （蘇州安泰），CO2培養(yǎng)箱 （美國(guó)NAPCO公司），熒光倒置顯微鏡 （日本OLYMPUS公司），BIORADModel680酶標(biāo)儀 （美國(guó)Bio-Rad公司）；96孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。

1.3 人外周血淋巴細(xì)胞分離、培養(yǎng) 無菌采取肝素抗凝靜脈血6～8 mL，1000 r/min離心5 min，取適量血漿于-20℃凍存?zhèn)溆?。去血漿后的血細(xì)胞用生理鹽水重懸，用Ficoll密度梯度離心（2100 r/min離心25 min），緩慢吸取白霧狀淋巴細(xì)胞層。將收集到的淋巴細(xì)胞集中于一支離心管中，用5倍于細(xì)胞懸液的1640培養(yǎng)基（不含血清）洗滌2次，以2000 r/min和1500 r/min各離心10 min，棄大部分上清。將洗滌后得到的淋巴細(xì)胞團(tuán)用少量RPIM1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、10 μg/mL PHA）輕輕打散，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/mL，于細(xì)胞懸液中加入10%的自體血漿［5］，混勻。分別接種于96孔和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.4 干預(yù)方法 分為4組進(jìn)行干預(yù)?？瞻讓?duì)照組：不加任何干預(yù)藥物；環(huán)瓜氨酸肽組：僅加環(huán)瓜氨酸肽干預(yù)（環(huán)瓜氨酸肽終質(zhì)量濃度為20 μg/mL）；甲氨蝶呤組：同時(shí)加環(huán)瓜氨酸肽與甲氨蝶呤干預(yù)（環(huán)瓜氨酸肽與甲氨蝶呤終質(zhì)量濃度均為20 μg/mL）；青藤堿組：同時(shí)加環(huán)瓜氨酸肽與青藤堿干預(yù)（環(huán)瓜氨酸肽與青藤堿終質(zhì)量濃度均為20 μg/mL）；每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集24孔板細(xì)胞上清，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定IFN–γ和IL-4的含量，經(jīng)對(duì)倍稀釋后，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書操作。于酶標(biāo)儀450/630 nm雙波長(zhǎng)下讀取吸光度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出樣品中IFN–γ和IL-4質(zhì)量濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。樣本干預(yù)前后采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以（±se）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組RA患者T細(xì)胞分泌IFN–γ的影響 見表1。與空白對(duì)照組相比，環(huán)瓜氨酸肽組IFN-γ升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甲氨蝶呤組、青藤堿組與環(huán)瓜氨酸肽組相比，IFN-γ均有所下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

表1 各組患者T細(xì)胞分泌IFN–γ、IL-4水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組患者T細(xì)胞分泌IFN–γ、IL-4水平比較（pg/mL，±s）

與環(huán)瓜氨酸肽組比較，*P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組 別 n IL-4 IFN-γ空白對(duì)照組 24 62.95±6.88 182.45±20.95環(huán)瓜氨酸肽組 24 56.67±7.39△ 195.32±19.55△甲氨蝶呤組 24 103.30±20.88* 189.22±20.89*青藤堿組 24 102.12±19.75* 186.32±21.04*

2.2 各組RA患者T細(xì)胞分泌IL-4的影響 見表1。與空白對(duì)照組相比，環(huán)瓜氨酸肽組分泌IL-4降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甲氨蝶呤組、青藤堿組與環(huán)瓜氨酸肽組相比，IL-4均有明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

3 討 論

RA是一種以對(duì)稱性、多關(guān)節(jié)受累為主要表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有研究提示，抗原提供的抗原性刺激為T細(xì)胞的激活提供重要信號(hào)，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)異常是RA發(fā)病關(guān)鍵。RA滑膜組織病理學(xué)表現(xiàn)為大量的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，也為RA是由T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病提供證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)到滑膜的CD4+、CD28-T細(xì)胞不需要共刺激信號(hào) （或通過其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）就能產(chǎn)生過量的IFN-γ，它們還表達(dá)穿孔素，溶解細(xì)胞，誘發(fā)炎癥。T細(xì)胞被不明因素激活后分泌的IFN-γ等致炎細(xì)胞因子，同時(shí)IL-4等抑炎因子的分泌異常，共同參與RA的誘發(fā)和延續(xù)，最終導(dǎo)致骨、關(guān)節(jié)的破壞。2000年，外國(guó)學(xué)者Schellekens首次人工合成環(huán)瓜氨酸肽，并用ELISA法在RA患者中檢測(cè)到抗環(huán)瓜氨酸肽抗體，有很好的敏感性和很高的特異性，分別為68%和98%，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體陽性是發(fā)展為RA最重要預(yù)測(cè)因素之一，也是侵蝕性關(guān)節(jié)損害的一個(gè)重要標(biāo)志及危險(xiǎn)因素［6-7］，總之，環(huán)瓜氨酸肽及其相關(guān)抗原是RA發(fā)病的重要靶抗原之一已成為目前研究的共識(shí)［8］。

本實(shí)驗(yàn)將環(huán)瓜氨酸肽作為抗原，體外干預(yù)RA患者外周血淋巴細(xì)胞，與環(huán)瓜氨酸肽干預(yù)前相比，RA患者分泌的致炎因子IFN-γ升高，抑炎因子IL-4下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P均＜0.05）。這與國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的環(huán)瓜氨酸肽可以促進(jìn)RA患者T淋巴細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞異?；罨?，從而參與RA的致病過程的結(jié)論是一致的［9］。進(jìn)一步干預(yù)此過程將有助于更好治療RA。已有的青藤堿治療RA的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，提示其對(duì)RA有較好的治療作用，青藤堿可抑制T淋巴細(xì)胞活化和增殖，顯著降低T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子TNF-γ、TNF-α分子表達(dá)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上研究青藤堿治療RA可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與RA環(huán)瓜氨酸肽組相比，青藤堿可抑制環(huán)瓜氨酸肽刺激RA患者的T細(xì)胞分泌致炎因子IFN-γ，增加抑炎因子IL-4分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。

總之，青藤堿可調(diào)節(jié)環(huán)瓜氨酸肽刺激的RA患者外周血T細(xì)胞分泌的相關(guān)致炎因子及抑炎因子，可能在RA的治療中發(fā)揮重要作用，具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

［1］黃國(guó)棟，李家邦，黃媛華，等.青藤堿治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎100例臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2007，16（4）：416-417，421.

［2］陳光星，王培訓(xùn)，劉清平，等.青藤堿對(duì)膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎免疫抑制作用的機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代免疫學(xué)，2008，28（2）：142-146.

［3］姚茹冰，高佩芳，虞偉，等.環(huán)瓜氨酸肽對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14（8）：937-939.

［4］Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，1988，31：315-24.

［5］Laura Fraccaroli，Julio Alfieri，Luciana Larocca，et al.A potential tolerogenic immune mechanism in a trophoblast cell line through the activation of chemokine induced T cell death and regulatory T cell modulation［J］.Human Reproduction，2009，24：166-175.

［6］Schellekens GA，Visser H，Dejong BA，et al.The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide［J］.Arthritis Rheum，2000，43（1）：155-163.

［7］Van Gaalen FA，Linn Rasker SP，Van Venrooij WJ，et al.Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis：a prospective cohort study［J］.Arthritis Rheum，2004，50（3）：709-715.

［8］黃梅，賈麗，李曉軍.抗CCP抗體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的臨床意義［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21（3）：289-292，297.

［9］穆榮，何箐，栗占國(guó).環(huán)瓜氨酸多肽對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎T細(xì)胞激活作用的研究［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，5（10）：273-275.

［10］陳光星，李曉娟，劉清平，等.青藤堿對(duì)T淋巴細(xì)胞活化增殖的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（5）：425-428.

［11］李曉娟，王培訓(xùn)，劉良，等.青藤堿對(duì)T淋巴細(xì)胞活化及TH1類細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2004，20（4）：249-252，258.