韓 寧 張 青 房位昊

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

目前缺血性中風(fēng)的西醫(yī)治療主要強(qiáng)調(diào)超早期溶栓和保護(hù)缺血后腦組織。溶栓的嚴(yán)格適應(yīng)證使其應(yīng)用受限，神經(jīng)保護(hù)劑有廣闊的應(yīng)用前景，尤其是神經(jīng)營養(yǎng)因子，但因其價(jià)格昂貴、難以透過血腦屏障，制約其應(yīng)用與發(fā)展。中醫(yī)藥在神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文通過建立腦缺血再灌注模型，從神經(jīng)營養(yǎng)因子合成與釋放角度探討榮絡(luò)健腦飲的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 130只健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量280～300 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）20050015。

1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）、多克隆抗體、SABC（兔IgG）、DAB顯色劑等，以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。榮絡(luò)健腦飲：人參12 g（單煎），鹿茸粉3 g（沖），龜甲 12 g（先煎），麥冬 30 g，菖蒲 15 g，川芎 20 g，赤芍 12 g，大黃 9 g，冰片 0.1 g（沖）。補(bǔ)陽還五湯：生黃芪 60 g，當(dāng)歸尾 12 g，赤芍12 g，川芎20 g，桃仁10 g，紅花15 g，地龍 15 g。 上述藥物購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。按常規(guī)方法制備，加水煎煮兩次，每次1 h，合并煎液，分別濃縮成含生藥1.0、1.3 g/mL的湯劑。

1.3 分組與造模 將大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、榮絡(luò)健腦飲組5組，后4組又分為1、2、7 d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組10只大鼠。根據(jù)改良Longa法，建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉大鼠，頸部備皮、消毒，沿頸部正中做一切口，分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉處2 mm扎一小孔，插入栓線，松開動(dòng)脈夾，插入深度距頸總動(dòng)脈分叉約（18.5±0.5）mm處，遇阻力即停止進(jìn)線，固定栓線并結(jié)扎，縫合皮下組織及皮膚。缺血1 h后，拔出栓線。參照Zea-Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，于大鼠術(shù)后進(jìn)行評(píng)分：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分，死亡。神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分為1～3分的大鼠即為成功模型。假手術(shù)組：分離各個(gè)血管，然后縫合皮膚。模型組、補(bǔ)陽還五湯組、榮絡(luò)健腦飲組：建立MCAO模型，缺血1 h再灌注1、2、7 d。

1.4 給藥方法 正常對(duì)照組：日常飼料，自由飲水。其余各組于造模前4 d開始給藥，模型組、假手術(shù)組灌胃生理鹽水、補(bǔ)陽還五湯組灌胃補(bǔ)陽還五湯、榮絡(luò)健腦飲組灌胃榮絡(luò)健腦飲，劑量均為10 mL/kg，每日1次，直至處死。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 10%中性甲醛灌注取腦，后將腦組織固定在甲醛溶液中。充分固定后，從視交叉后3 mm處取大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦組織2 mm，行石蠟包埋，每一組織蠟塊連續(xù)4 μm切片4張，1張行常規(guī)HE染色，3張分別行 NGF、BDNF、bFGF免疫組化染色。觀察腦缺血1 h再灌注1、2、7 d后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分。對(duì)免疫組化切片行計(jì)算機(jī)定量分析，測(cè)出NGF、BDNF、bFGF表達(dá)的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用經(jīng)q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較 見表1。各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分有隨時(shí)間而變化的趨勢(shì)，但時(shí)間因素的作用不隨分組的不同而不同，而且總體而言各組有差異。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上各組比較，榮絡(luò)健腦飲組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分在不同時(shí)間點(diǎn)較模型組均明顯改善（P＜0.05）。在腦缺血再灌注第2日、第7日，榮絡(luò)健腦飲在改善大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分方面優(yōu)于補(bǔ)陽還五湯（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（分，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 第2日 第7日正常對(duì)照組 - 0 n 第1日10 -假手術(shù)組 0 0 10 0模型組 10 2.83±0.41 2.50±0.55 1.83±0.41補(bǔ)陽還五湯組 10 2.33±0.52 1.83±0.41* 1.33±0.52*榮絡(luò)健腦飲組 10 1.86±0.38* 1.14±0.38*△ 0.71±0.49*△

2.2 HE染色切片在光鏡下觀察結(jié)果 正常對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)、髓質(zhì)未見明顯病理改變。模型組可見較大的灶性水腫或軟化灶形成，胞核變性、壞死，甚則細(xì)胞溶解、消失，并伴慢性炎性細(xì)胞浸潤，或伴間質(zhì)細(xì)胞增生，部分成纖維細(xì)胞增生、纖維化形成。補(bǔ)陽還五湯組和榮絡(luò)健腦飲組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組比較病理改變程度較輕，其中以榮絡(luò)健腦飲組最輕。

2.3 各組大鼠腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá) 見表2～表4。與同時(shí)段的模型組、補(bǔ)陽還五湯組比較，榮絡(luò)健腦飲組各神經(jīng)營養(yǎng)因子的陽性表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腦缺血再灌注1、2、7 d不同的時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)陽還五湯組大鼠腦組織NGF、BDNF的表達(dá)均增強(qiáng)，對(duì)bFGF的影響于缺血再灌注第2、7日顯著，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織NGF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織NGF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對(duì)照組 153.42±6.70 153.42±6.70 n 第1日10 153.42±6.70假手術(shù)組 159.08±5.59 157.14±7.15 10 153.90±8.54模型組 10 133.66±7.23 127.99±9.70 135.48±7.98補(bǔ)陽還五湯組 10 118.41±6.75* 113.53±3.77* 126.46±7.34*榮絡(luò)健腦飲組 10 109.05±7.56*△ 104.87±8.14*△ 115.23±4.93*△

表3 各組大鼠腦組織BDNF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織BDNF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對(duì)照組 163.42±6.41 163.42±6.41 n 第1日10 163.42±6.41假手術(shù)組 162.16±4.89 161.73±9.12 10 160.90±6.69模型組 10 121.66±10.37 135.31±7.08 138.30±7.05補(bǔ)陽還五湯組 10 112.41±6.49* 122.83±8.72* 132.53±8.75*榮絡(luò)健腦飲組 10 103.05±6.37*△ 112.26±8.10*△ 119.79±7.13*△

表4 各組大鼠腦組織bFGF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織bFGF表達(dá)平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對(duì)照組 161.62±6.55 161.62±6.55 n 第1日10 161.62±6.55假手術(shù)組 158.62±5.29 155.48±8.14 10 159.69±6.30模型組 10 141.09±7.29 130.70±8.23 142.62±8.28補(bǔ)陽還五湯組 10 132.97±11.12 123.62±5.40* 130.02±4.88*榮絡(luò)健腦飲組 10 121.50±8.56*△ 109.81±6.98*△ 120.64±6.00*△

3 討 論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)成熟、維持神經(jīng)功能的蛋白質(zhì)。其中發(fā)現(xiàn)最早的是NGF，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。腦損傷時(shí)腦內(nèi)源性NGF在皮層和海馬區(qū)域的表達(dá)增加［1-2］，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。而且外源性NGF的應(yīng)用可減少梗死體積并減輕腦水腫［3］。將鼠神經(jīng)生長因子用于臨床，發(fā)現(xiàn)其能有效減少患者的神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，是一種有效治療急性腦梗死的藥物［4］。

BDNF是一種在神經(jīng)元損傷后再生修復(fù)和防止神經(jīng)細(xì)胞退行性變等多方面發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子［5］。腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)BDNF極早表達(dá)，從多個(gè)方面抑制各種缺血再灌注損傷反應(yīng)。如BDNF可誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白表達(dá)從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度［6］；下調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸受體功能，以此拮抗興奮性氨基酸的毒性［7］；抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)、膠質(zhì)細(xì)胞的活性和巨噬細(xì)胞的浸潤，自由基的生成［8］；通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl表達(dá)抑制β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］等。

bFGF是FGF家族9個(gè)成員之一，不但能促進(jìn)細(xì)胞增生分化和血管生成，還可明顯減輕缺血性腦損傷［10］。MCAO后缺血側(cè)幾個(gè)腦區(qū)的bFGF mRNA與bFGF免疫反應(yīng)增加［11］，bFGF表達(dá)后可通過調(diào)控HSP70蛋白和p53凋亡相關(guān)基因而發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用［12］。

筆者將內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子歸屬于中醫(yī)“精”的范疇，并認(rèn)為肝腎陰虛、氣血衰少是致病之本，痰瘀阻絡(luò)、腦髓失養(yǎng)是疾病難愈的主因。補(bǔ)腎益精、榮絡(luò)活血，則可使腦髓充盈，元神功能正常，中風(fēng)時(shí)出現(xiàn)的神昏、半身不遂、偏身麻木等癥狀得以恢復(fù)。據(jù)此，筆者擬定了具有益氣填精、榮絡(luò)活血功效的榮絡(luò)健腦飲治療中風(fēng)。方中多味中藥均可抵抗腦缺血再灌注損傷，且菖蒲、冰片引藥入腦，促進(jìn)其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明榮絡(luò)健腦飲可減輕腦缺血再灌注損傷造成的病理改變，降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，促進(jìn)腦組織NGF、BDNF、bFGF的表達(dá)，與補(bǔ)陽還五湯比較，有顯著差異。促進(jìn)腦組織NTF的表達(dá)是榮絡(luò)健腦飲的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一。本研究從神經(jīng)營養(yǎng)因子合成與釋放角度，進(jìn)一步闡釋了扶正護(hù)腦法治療缺血性中風(fēng)的作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥對(duì)中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)治療提供了依據(jù)。

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