宓 丹 馬賢德 王 建

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽110034；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

近年來研究表明腦缺血、缺氧后可刺激機(jī)體產(chǎn)生各種生長相關(guān)因子，這些生長因子可以減輕神經(jīng)元的損傷，促進(jìn)神經(jīng)元的再生。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是一種多功能生長因子，可延長神經(jīng)元的存活，具有神經(jīng)保護(hù)作用。已有研究表明眼針可以通過抑制TNF［1］等炎癥因子來治療腦缺血，但是否可以通過促進(jìn)各種生長因子來治療缺血性腦血管疾病尚未見報道。本研究通過觀察眼針對局灶性腦缺血大鼠模型海馬組織TGF-β1表達(dá)影響，來進(jìn)一步探討眼針治療缺血性腦血管疾病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 兔抗鼠TGF-β1抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒及DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物與分組 健康SPF級SD大鼠90只，雌雄不拘，體質(zhì)量（280±20）g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，許可號：SCXK（滬）2008-0016。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對濕度45%。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、假手術(shù)3 h組、假手術(shù)24 h組、假手術(shù)72 h組、模型3 h組、模型24 h組、模型 72 h組、眼針3 h組、眼針24 h組、眼針72 h組，共10組，每組9只。

1.3 模型制備 參照文獻(xiàn)［2］，模型組及眼針組采用改良線栓法復(fù)制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。大鼠于缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分，參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)［3］：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型、眼針組，區(qū)別在于魚線插入深度為0.5～1 cm。空白組未做處理。

1.4 干預(yù)方法 眼針組：用31號13 mm毫針，于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法［4］，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。手法：平刺，進(jìn)針3 mm。留針20 min，留針期間捻轉(zhuǎn)行針3次，每次1 min。治療時機(jī)：眼針組于腦缺血再灌注即刻進(jìn)行眼針治療，存活期間每12小時1次；眼針3 h組于取材前30 min再進(jìn)行眼針治療1次。

1.5 標(biāo)本采集與處理 動物完成觀察時間后，以10%水合氯醛（3.5 mL/kg體質(zhì)量）腹腔麻醉，開胸暴露心臟，將灌注針頭插入心臟，剪開右心耳，依次迅速灌注0.9%氯化鈉注射液200 mL、4℃的4%多聚甲醛200 mL，灌注至無血色止，灌畢迅速取腦，在視交叉平面前后5～10 mm處將腦冠狀切面切開，留取中間部分置于4℃的4%多聚甲醛固定液中過夜。常規(guī)上行脫水、透明后用石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚5 μm，每隔10張取1張，使每張切片上都有海馬組織。

1.6 指標(biāo)檢測 采用免疫組化（SABC法）檢測。切片脫蠟至水，抗原修復(fù)液修復(fù)，滴加封閉液，滴加1∶100兔抗鼠抗體，過夜，加SABC。DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明，封片。采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對采集的圖像測定陽性反應(yīng)物的灰度，細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)清晰棕褐色顆粒為陽性。每例動物隨機(jī)取3～4張切片，且各組所選部位相同。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以 （±s）表示。組間比較采用單因素方差分析處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較 見表1。模型組和眼針組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等；假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。模型組大鼠神經(jīng)功能障礙在24 h達(dá)到高峰，隨時間延長，72 h時大鼠神經(jīng)功能障礙減輕但無明顯差異。眼針組與模型組相比，在再灌注損傷3 h后神經(jīng)功能缺損程度評分無差異，隨時間延長眼針組大鼠神經(jīng)功能障礙減輕，與模型組比各時間點大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分有差異（P＜0.05）。

表1 眼針對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

表1 眼針對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 24 h 72 h空白組 0 0 n 3 h 9 0假手術(shù)組 0 0 9 0模型組 9 2.2±0.6 2.7±0.4 2.3±0.5眼針組 9 2.1±0.6 2.0±0.7* 1.5±0.9*

2.2 各組大鼠海馬組織TGF-β1表達(dá)比較 見表2?？瞻捉M和假手術(shù)組可見TGF-β1蛋白微量表達(dá)，模型組和眼針組大鼠各時間點TGF-β1蛋白含量與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組TGF-β1蛋白含量在腦缺血再灌注3 h開始增加，隨缺血時間延長逐漸升；在相應(yīng)各時間點，眼針組TGF-β1蛋白含量較模型組增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，以腦缺血再灌注72 h升高最為明顯（P＜0.05或0.01）

表2 各組大鼠海馬組織TGF-β1表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織TGF-β1表達(dá)比較（±s）

組 別 24 h 72 h空白組 - -n 3 h 9 0.203±0.0018假手術(shù)組 0.203±0.0021 0.204±0.0025 9 0.203±0.0016模型組 9 0.273±0.020 0.322±0.021 0.368±0.005眼針組 9 0.289±0.012* 0.348±0.021* 0.397±0.002**

3 討 論

TGF-β是一種生物效應(yīng)比較廣泛的生長因子，參與細(xì)胞的增殖和分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)的合成以及血管生成等體內(nèi)生理學(xué)過程，在纖維化、損傷修復(fù)和腫瘤生長等許多病理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［5］。其中TGF-β1在哺乳動物體細(xì)胞體系中所占的比例最高（＞90%），活性最強(qiáng)，與疾病關(guān)系最密切，成為研究的熱點。在生理情況下，TGF-β1呈低水平表達(dá)；缺血、缺氧可以刺激TGF-β1的表達(dá)。Kyupinski等［6］對10例缺血性卒中患者死亡24 h內(nèi)的腦組織進(jìn)行病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，所有神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，特別是少突膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)TGF-β1mRNA，微血管周圍的巨噬細(xì)胞和梗死組織的內(nèi)皮細(xì)胞也有較強(qiáng)表達(dá)。對側(cè)腦組織中TGF-β1mRNA水平最低，缺血半暗帶最高。李華軍等［7］通過對小鼠全腦缺血再灌注TGF-β1在缺血組織中的表達(dá)檢測，結(jié)果表明缺血30 min及再灌注早期TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，但隨著再灌注時間延長，壞死加重，TGF-β1表達(dá)下降。而缺血半影區(qū)TGF-β1表達(dá)隨缺血再灌注時間延長逐漸增強(qiáng)。此趨勢說明，它在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制中起著重要作用，參與腦缺血后神經(jīng)元的保護(hù)與修復(fù)作用。缺乏TGF-β1基因表達(dá)的新生小鼠會出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)元變性，同時伴有突觸素和層黏蛋白表達(dá)下降以及顯著的小膠質(zhì)增生。這種缺乏TGF-β1基因小鼠的神經(jīng)元在體外培養(yǎng)時存活時間明顯縮短，并且成年小鼠易受到興奮性毒性損傷［8］。作為一種活性很強(qiáng)的血管生成調(diào)節(jié)因子，TGF-β1還可激活缺血半暗帶的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)微血管再生。研究表明，TGF-β1能夠與堿性成纖維生長因子和巨噬細(xì)胞一起誘導(dǎo)血管生成，并有利于轉(zhuǎn)運(yùn)壞死組織和神經(jīng)重塑［9］。體內(nèi)和體外實驗均已經(jīng)證實了TGF-β1的神經(jīng)保護(hù)作用。但是由于TGF-β1無法通過血腦屏障，因此對于利用外源性TGF-β1治療缺血性腦血管疾病的研究一直無法應(yīng)用于臨床。

名老中醫(yī)彭靜山教授根據(jù)中醫(yī)學(xué) “五輪八廓”等理論結(jié)合“八卦”學(xué)說，建立“八區(qū)十三穴絡(luò)腦通臟腑”理論。臨床上通過觀察眼睛各區(qū)中脈絡(luò)形態(tài)和色澤變化以診斷疾病，依據(jù) “觀眼識病”創(chuàng)立了彭氏眼針療法。40多年的臨床百余萬病例實踐證明，眼針療法對腦梗死病患者治療效果確切顯著，是一種簡便有效、無不良反應(yīng)、易于推廣的療法。

中風(fēng)病的基本病機(jī)之一為肝腎陰虛，偏癱的上、下肢分別歸屬上焦區(qū)、下焦區(qū)，故本實驗用眼針取肝區(qū)、腎區(qū)以滋補(bǔ)肝腎治病求本，取上焦區(qū)、下焦區(qū)以活血通絡(luò)治其標(biāo)。實驗結(jié)果表明，假手術(shù)組和空白組TGF-β1微量表達(dá)；模型組3 h可見TGF-β1表達(dá)上升與假手術(shù)組比有差異（P＜0.05），隨缺血時間延長，TGF-β1蛋白表達(dá)持續(xù)升高，說明缺血缺氧可刺激其表達(dá)；眼針組TGF-β1蛋白表達(dá)趨勢與模型組一致，各時間點與模型組比有明顯差異，以72 h時間點差異最為明顯。而眼針組大鼠模型神經(jīng)功能缺損評分明顯下降 （P＜0.05）。說明眼針可以通過刺激肝區(qū)、腎區(qū)、上焦、下焦，對內(nèi)源性TGF-β1的生成加以干預(yù)調(diào)節(jié)使其增，從而通過一系列免疫介導(dǎo)減輕神經(jīng)元的損傷，改善神經(jīng)功能障礙。但是眼針如何促進(jìn)TGF-β1表達(dá)的機(jī)理目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

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