陶華娟 張艷 郎翠紅

（濰坊市婦幼保健院 遺傳科，山東 濰坊 260011）

1 前 言

染色體不分離和結構不平衡在新生兒中的發(fā)生率為1／200［1］，成為發(fā)育缺陷和先天畸形的主要原因。因此，細胞遺傳學分析一直被認為是很重要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法。

從1966年首次應用孕中期羊水脫落細胞培養(yǎng)或孕早期絨毛采樣進行產(chǎn)前檢測，到19世紀70年代常規(guī)應用染色體顯帶分析（核型分析）以來，此方法已經(jīng)成為經(jīng)典的產(chǎn)前診斷技術［2］。核型分析作為一種可靠的方法，可以診斷染色體數(shù)目異常及500萬至1000萬對堿基對的結構重排。羊水細胞核型分析的準確率為99.4%～99.8%，絨毛膜細胞核型分析的準確率為97.5%～99.6%［3］。然而，核型分析的局限性在于必須進行細胞培養(yǎng)，大多數(shù)臨床實驗室出報告的時間為10～14天。

近10年來，21-三體綜合征及其他染色體疾病的無創(chuàng)篩查技術已有了根本性提高。為了改善孕期管理和緩解孕婦焦慮的情緒，需要一種快速的方法來確診這些疾病，且大量臨床研究表明這些方法能在產(chǎn)前診斷中檢測出大多數(shù)的染色體異常。因此，將傳統(tǒng)核型分析作為經(jīng)典產(chǎn)前診斷方法保留還是被快速的方法所取代還存在爭議。本文將討論臨床上最常用的3種快速診斷非整倍體染色體疾病的方法：分裂相的原位熒光雜交（iFISH）、熒光定量聚合酶鏈反應（QF-PCR）、多重連接探針擴增技術（MLPA）。

2 方 法

iFISH、QF-PCR、MLPA 和其他一些新的方法可以快速檢測（約1～2天）最常見的常染色體異常如13-三體（帕塔綜合征）、18-三體（愛德華綜合征）和21-三體（唐氏綜合征），而性染色體異常如特納綜合征（單體X）、克蘭費爾特綜合征（XXY）和三倍體，嵌合體和結構重排，包括平衡和不平衡易位、大量的基因缺失和復制、插入和標記染色體等，只有很少一部分能夠在產(chǎn)前檢測。

2.1 熒光原位雜交技術 近20年來，熒光原位雜交技術（FISH）技術有了很大的發(fā)展。相對于傳統(tǒng)的核型分析來說，F(xiàn)ISH 能更好地檢測和分析某些罕見的染色體結構異常，包括微缺失綜合征、隱匿性的或輕微的基因復制和置換、復雜的重排和標記染色體。它是通過特定的染色體探針來檢測羊水或絨毛樣本中的分裂間期的細胞，從而快速（需1～2個日）診斷常見的非整倍體染色體疾病。通過這種方法，可以避免傳統(tǒng)核型分析中因需要進行細胞培養(yǎng)而延誤報告時間。大量研究發(fā)現(xiàn)，用于對分裂間期的細胞核進行FISH 檢測的商業(yè)化試劑盒的靈敏度和特異度都很高，且在診斷應用中也被證實。許多實驗中心現(xiàn)在都依據(jù)FISH 檢測結果，如發(fā)現(xiàn)常見的三體時，就不需要等細胞培養(yǎng)后的核型分析結果了。但是，分裂間期FISH 檢測方法因使用探針而受到限制，許多罕見的染色體結構和數(shù)目異常均不能被檢出。因此FISH 的結果有時有局限性，仍需要核型分析來最終確診。

在產(chǎn)前診斷中應用FISH 檢測的同時仍需要同時進行傳統(tǒng)的核型分析，因為其僅能快速診斷非整倍體染色體。

2.2 熒光定量聚合酶鏈反應 在歐洲，最常用的快速檢測非整倍體的產(chǎn)前診斷方法是熒光定量聚合酶鏈反應（QF-PCR）。QF-PCR 檢測的原理是建立在選擇性的短串聯(lián)重復片段（STRs）基礎上，這些片段是由2～5個核苷酸組成的基因片段多次重復形成的。這些片段的多態(tài)性與某一特定位點重復的數(shù)量不同有關，進而產(chǎn)生了不同長度的等位基因。STRs很容易通過PCR 擴增多態(tài)性片段來檢出，它產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物與目標片段的數(shù)量是成正比的。QF-PCR可以通過非多態(tài)性釉質(zhì)（AMXY）基因進行性別鑒定，可依據(jù)此基因序列的不同來鑒定不同長度的X-、Y-特定產(chǎn)物，此外，通過分析此基因序列還可以鑒定性染色體數(shù)目異常（47，XXY，47，XYY，48，XXXY）［4，5］。

經(jīng)過最初的實驗室和臨床試驗后，QF-PCR 檢測方法已在幾個產(chǎn)前診斷中心被常規(guī)使用（主要在歐洲地區(qū)）。它能借助羊水標本和計算機系統(tǒng)來正確診斷所有正常的染色體核型，13、18、21-三體，雙三體（48，XXY，t21；48，XXY，t18）及非嵌合的性染色體異常，通常在24～48小時出檢測報告，能緩解超過95%的父母因等待核型分析結果產(chǎn)生的緊張情緒［6，7］。到目前為止，已經(jīng)有超過25萬個樣本使用QF-PCR 檢測，雖然不同的中心使用的試劑盒不同，但它的結果是真實可靠的，沒有假陽性和假陰性結果。

目前還沒有關于QF-PCR 的假陽性報道，在許多國家和機構將其作為一種是否終止妊娠的依據(jù)，而不需要等待核型分析的結果。

2.3 多重連接探針擴增技術 包括QF-PCR 在內(nèi)，多重連接探針擴增技術（MLPA）是第二種以PCR 為基礎的檢測非整倍體染色體疾病的方法。它是一種以PCR 為基礎的多樣化的方法，主要是用來決定反應管中超過50個基因的DNA 或RNA 序列的拷貝數(shù)［8］。這個技術應用廣泛，其中SALSA P095試劑盒是專門用來檢測產(chǎn)前診斷中常見非整倍體疾病的。

在這個試劑盒中，13、18、21、X 染色體均分別對應8個基因座，而Y 染色體對應4個基因座。正如用QF-PCR 檢測單位點的結果需要與相同樣本的基因座結果相比較，同樣，用MLPA 檢測單位點的結果也需要有相應的對照，這個對照是指檢測二倍體DNA 樣本的相同基因座的結果，最終得出一比率。如果這個比率接近于1，那么該基因座中DNA的量與對照組是相同的，即也是二倍體。如果該比率＜0.7或＞1.3，那么該基因座中DNA 的量就會少于或多于對照組。故而，依據(jù)8個（13，18，21和X）或4個（Y）染色體基因座的結果就能算出相關染色體拷貝數(shù)。

與FISH 和QF-PCR 相比，MLPA 不能檢測 出女性的三倍體。因為不管在正常女性還是三倍體女性染色體中，X 染色體和常染色體的Ratio值是相同的。然而，三倍體的女性胎兒均伴有超聲的異常，因此可通過超聲診斷來預防三倍體患兒的出生。

就像FISH 和QF-PCR，在許多實驗室已經(jīng)將MLPA 作為決定是否終止妊娠的依據(jù)，而不需要等待核型分析來確診［9］。

3 困難和策略

3.1 絨毛膜絨毛 絨毛存在于不同的細胞系中：即細胞滋養(yǎng)層細胞系和間充質(zhì)核細胞系，這種現(xiàn)象將影響絨毛的分子生物學研究。核型分析表明，這些細胞系之間可能會出現(xiàn)遺傳差異。

熒光定量PCR（QF-PCR）和核型分析結果之間的微小差異已有報道。在大多數(shù)情況下，研究的僅僅是單一的絨毛膜絨毛，而與絨毛膜絨毛相關的嵌合現(xiàn)象可引起結果的微小差異［10，11］。

Mann等［12］研究表明，將細胞滋養(yǎng)層的外層用消化酶去掉后，僅對從間質(zhì)核細胞分離出的DNA進行MLPA，MLPA 的結果與核型分析的結果完全一致。這些核型分析的樣本來源于相同細胞型分裂中期的細胞（長期培養(yǎng)分析）。Kooper等［13］研究了7個絨毛膜絨毛的MLPA 資料。這些資料表明，不管是短期培養(yǎng)還是長期培養(yǎng)，核型分析結果均有差異。然而他們用蛋白酶K 消化整個絨毛后，導致了來源于滋養(yǎng)層細胞的DNA 過表達（在短期培養(yǎng)中）。并且用酶消化法分離了來源于間質(zhì)核的滋養(yǎng)層細胞，然后分離出來的DNA 進行了MLPA 檢測和核型分析，并且盡量均行短期與長期細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MLPA 的結果與核型分析的結果一致。這表明，經(jīng)酶消化產(chǎn)生的細胞碎片與用于核型分析的碎片結構差不多。

3.2 母細胞污染 在產(chǎn)前診斷中一個最常見的現(xiàn)象是母體細胞的污染。因為母體的細胞不能或很難在長期培養(yǎng)中生長，因此一般不會影響核型分析的結果。然而，在理論上，這一現(xiàn)象可影響分子學的方法（包括FISH），因為這些檢驗用的材料是未經(jīng)培養(yǎng)的細胞。

包括應用QF-PCR，我們希望能夠通過放大的高度多態(tài)性的STRs序列來發(fā)現(xiàn)新的等位基因或者在所有染色體之間非對稱性的特征型基因。這些序列一般不同于正常的、三體的或者三倍體的序列。所以可依據(jù)這些序列來進行檢測，而不存在誤診的情況。正因為這樣，在生長緩慢的CVS 培養(yǎng)中，QF-PCR 有助于分別出正常的母體核型來確定所檢測的細胞是胎兒來源的細胞，進而排除母體細胞的過度生長。

不同于QF-PCR，有人用MLPA（和FISH）研究了單拷貝基因座或染色體區(qū)的拷貝數(shù)，而不是在單位點上的等位基因數(shù)。結果表明，不會在女性胎兒中檢測到母細胞的污染。在男性胎兒中，僅僅X和Y 基因座的比率異常時，才懷疑母細胞污染。事實上，所有的MLPA 研究均有可能因母細胞污染而導致誤診。然而，MLPA P095 檢測嵌合體的最低下限是-20%［13］。因此，從胎兒和母體DNA 混合物獲得的胎兒嵌合的DNA 來行MLPA 檢測，即使在母體細胞污染率高達80%時，也可能發(fā)現(xiàn)胎兒三體性疾病。

3.3 嵌合現(xiàn)象 嵌合現(xiàn)象在產(chǎn)前診斷技術中很常見，但診斷有時比較困難。對常規(guī)的核型分析來說，嵌合現(xiàn)象的檢測水平主要是由被分析細胞的數(shù)量決定的。例如，當分析10 個分裂中期的細胞時，有26%的嵌合現(xiàn)象被排除（95%的置信區(qū)間），而當分析12 個時，23%的嵌合現(xiàn)象被排除（95%的置信區(qū)間）。

大部分分子生物學實驗方法能夠檢測到更低水平的嵌合現(xiàn)象，但仍有不到10%～20%的嵌合現(xiàn)象沒有被檢測到。就像核型分析一樣，在檢測2個或更多細胞系時，F(xiàn)ISH、QF-PCR 和MLPA 的靈敏度主要決定于嵌合現(xiàn)象的水平和相關的染色體。比如，應用FISH 技術，46，XX／45X 的嵌合體能夠很容易的檢測出來；而對QF-PCR 和MLPA 來說，當異常細胞系不足20%時，這些嵌合能夠通過X 染色體標志的不平衡等位基因比率來識別［14］。45，X 和47，XXX 細胞等比嵌合的現(xiàn)象，不能用QF-PCR 或MLPA 檢測出來，因為這就像在正常的女性胎兒一樣，這些細胞產(chǎn)生了相同的等位基因比率。但是，用FISH 則可輕易檢測。

X 染色體嵌合現(xiàn)象中的一些病例中，分子生物學與細胞遺傳學關于異常細胞亞群百分率的差異，可能是由于正常（46，XX 或46，XY）和45，X 細胞生長速度不同引起的，因為非整倍體細胞系生長普遍比正常細胞快［15］。性染色體的嵌合體45，X／46，XY，盡管能夠輕易的用分子生物學方法檢測到，但是經(jīng)過細胞培養(yǎng)后常常成為單純的45，X 核型。

上述3種方法中的任何一種，理論上都可以大規(guī)模地應用于非整倍性的檢測，但FISH 因花費很高，并且耗時，故而QF-PCR 和MLPA 成為最通用的檢查手段，后兩者的主要優(yōu)點之一是自動操作。目前，在產(chǎn)前診斷中對非整倍體染色體疾病使用快速檢測最主要的目的是提高孕期管理，或是為那些超聲顯示無明顯異常的大多數(shù)患者快速提供檢測結果，可以短時間內(nèi)減少焦慮和壓力。

這些快速產(chǎn)前診斷方法的使用在一些國家中仍有爭議，因為最近一些研究發(fā)現(xiàn)有些患者的超聲顯示正常且QF-PCR 檢測沒有發(fā)現(xiàn)的染色體異常，進而出現(xiàn)了漏診的情況［16］。

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