高波 吳曉琰 陸怡

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海 200040）

心房利鈉肽的抗腫瘤作用及其基因工程表達

高波 吳曉琰 陸怡

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年病科，上海 200040）

自心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）被發(fā)現(xiàn)以來，其擴張血管、降壓、增加血管通透性、利鈉利尿等心血管系統(tǒng)方面的作用已得到認可，近年來發(fā)現(xiàn)ANP在抗腫瘤方面具有潛在的巨大價值。

1 ANP的代謝和組成

1.1 ANP的合成和降解

早在1956年Kisch就發(fā)現(xiàn)心房具有內(nèi)分泌功能［1］。1981年 Adolfo de Bold［2］發(fā)現(xiàn)第1個利鈉肽類激素，它是通過心房心肌細胞的分泌型顆粒旁分泌發(fā)揮作用。Potter等［3］將其稱為ANP。ANP可由心房、心室、腎臟、脂肪組織及腦細胞表達，通過心房顆粒釋放ANP原［4］。合成ANP的基因被稱為NPPA基因（natriuretic peptide A），位于染色體1p36.21，它可合成含151個氨基酸的前ANP原（prepro－ANP），加工切斷其前25個氨基酸后即變成含126個氨基酸的ANP原（pro－ANP）。ANP可激活穿膜的鳥苷酸環(huán)化酶（guanylyl cyclase）即 利 鈉 肽 受 體－A（natriuretic peptide receptor－A，NPR－A）。NPR－A可以促進環(huán)GMP（cyclic GMP，cGMP）的合成，從而將信息傳達到胞內(nèi)發(fā)揮作用。另一種ANP相關(guān)的受體是利鈉肽受體－C（natriuretic peptide receptor－C，NPRC），它可以通過受體介導(dǎo)的攝取和降解作用清除血液循環(huán)中的利鈉肽類激素。

1.2 ANP的組成、結(jié)構(gòu)和生理功能

pro－ANP中包括4個肽類激素，以它們在ANP激素原N端的氨基酸序列進行排序，ANP激素原N端的前30個氨基酸組成長效利鈉肽（long acting natriuretic peptide，LANP），31～67共37個氨基酸組成血管擴張肽（vessel dilator，VD），79～98共20個氨基酸組成利鉀肽（kaliuretic peptide，KP），99～126共28個氨基酸組成α－人心房利尿肽（α－h(huán)uman artrial natriuretic peptide，α－h(huán) ANP）。這4種多肽均在血液循環(huán)中存在，它們除有擴張血管、降壓、延緩肺動脈高壓進展、增加血管通透性、利鈉利尿等心血管系統(tǒng)作用外，在抗腫瘤方面也有著潛在的應(yīng)用價值［5］。

2 ANP與癌癥

2.1 ANP的抗癌作用及機制

研究［6］發(fā)現(xiàn)ANP來源的心房肽類激素可以直接殺死腫瘤細胞或強力抑制癌細胞DNA的合成，從而抑制癌細胞的生長，而對正常的人體細胞無損傷；它還可緩解抗癌藥物對腎臟、肝臟的毒性作用。這4種心臟激素可單獨或聯(lián)合應(yīng)用于多種腫瘤的治療。體外實驗［7］顯示，α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP這4種ANP來源的心房肽類激素在體外培養(yǎng)的細胞中24 h可抑制近97%的人胰腺癌細胞、乳腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞、卵巢癌細胞以及肺小細胞癌和肺鱗狀細胞癌的癌細胞；且在裸鼠體內(nèi)可使人胰腺癌細胞及人乳腺癌細胞減少80%以上，使人肺小細胞癌細胞減少86%以上。

ANP來源的心房肽類激素主要是以腫瘤細胞中的 Ras－Raf－MEK 1/2－ERK 1/2 激 酶 級 聯(lián)為靶點［7－8］。Ras－Raf－MEK1/2－ERK1/2 信 號 通 路 是Ras受上游信號激活后連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白激酶，使下游蛋白磷酸化而產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)。Raf被Ras激活后，激活下游的絲裂原活 化 細 胞 外 調(diào) 節(jié) 激 酶 1/2 （mitogen－activated protein/extracellular signed－regulated kinase 1/2，MEK1/2），MEK1/2進而激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase1/2，ERK1/2），活化的ERK1/2進入細胞核，磷酸化特定基因上的特定位點，調(diào)控轉(zhuǎn)錄。該信號通路在細胞增殖，細胞調(diào)亡，細胞分化、癌變等方面起著重要的作用，在多種腫瘤組織與細胞中均可檢測到Ras－Raf－MEK－ERK通路的異常過度激活。α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP可抑制達95%的基礎(chǔ)Ras的活性、98%的 MEK 1/2的磷酸化以及97%的基礎(chǔ)ERK1/2的激活。ANP來源的心房肽類激素的抗癌機制均是通過進入細胞核抑制腫瘤細胞的DNA合成［7］。進一步的實驗［9］證明α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP分別抑制有絲分裂原表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）激活Ras的作用，濃度為1 μmo L的α－h(huán) ANP、VD、LANP及 KP抑制5 ng/m L的EGF激活Ras的程度分別是33%、73%、79%及45%。對EGF的特異作用可以用5μmo L的心臟激素抗體阻斷，其程度分別是100%、95%、93%及100%。這項研究表明ANP來源的心房肽類激素可以抑制有絲分裂原，如EGF激活Ras的活性及非刺激的基礎(chǔ)的Ras活性。

2.2 ANP治療腫瘤的研究

目前研究ANP相關(guān)的肽類激素治療腫瘤有效的研究綜述如下。

小細胞肺癌（體外實驗）［10］:濃度為1μmoL的4種肽類激素（VD、LANP、KP和α－h(huán) ANP）及cGMP 24 h內(nèi)可降低依次為63%、21%、30%、39%及31%的體外培養(yǎng)的小細胞肺癌的癌細胞數(shù)，且在細胞數(shù)量減少后的3 d內(nèi)沒有細胞增生；在劑量曲線上，VD為100 μmoL時，24 h內(nèi)減少92%肺腺癌細胞。

乳腺癌（激素小鼠及裸鼠體內(nèi)試驗）［11］:4種心房肽類激素混合，可殺死54%的小鼠人HTB－132乳腺癌細胞及60%的CRL－2327乳腺癌細胞，同時發(fā)現(xiàn)其在未進行外科切除手術(shù)情況下使50%的雌性小鼠的HTB－132人乳腺癌消失且不再復(fù)發(fā)。

前列腺癌 （體外實驗））［12－13］:在體外實驗中，ANP、LANP在濃度為0.01～1μmo L時抑制Ras磷酸化，抑制Ras－GTP激活，通過cGMP途徑發(fā)揮抗人前列腺癌的作用。在濃度為0.01～10μmo L時，兩者抑制MEK 1/2激酶磷酸化的程度分別是97%、88%，其抑制作用在2 h達高峰，4 h停止，這種抑制作用可被cGMP抗體阻斷，cGMP本身抑制MEK 1/2激酶的程度磷酸化的程度可達93%。

黑 色 素 瘤 （體 外 實 驗））［14］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP這4種心房肽類激素濃度為1μmo L時可在24 h內(nèi)使體外培養(yǎng)的黑色素瘤細胞減少71%，每一種激素可使DNA合成減少達73%，通過cGMP途徑發(fā)揮抗癌作用。

結(jié)腸腺癌（體外實驗）［15］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP在1 mmoL濃度時24 h使體外培養(yǎng)的結(jié)腸腺癌細胞減少89%～97%，使其DNA合成減少65%～83%（P＜0.001），通過cGMP途徑發(fā)揮作用。

肺鱗 狀 細 胞 癌 （體 外 實 驗）［16］:α－h(huán) ANP、VD、LANP、KP及cGMP抑制體外培養(yǎng)的人癌細胞的程度分別為21%、51%、22%、25%及30%。VD抑制細胞DNA合成達85%，這種抗癌作用由cGMP介導(dǎo)。

膠質(zhì)母細胞瘤（體外實驗）［17］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP可消除近75%的體外培養(yǎng)的膠質(zhì)母細胞瘤，通過cGMP途徑使DNA合成減少近87%。

血 管 肉 瘤 （體 外 實 驗 ）［18］:α－h(huán) ANP、VD、LANP、KP及cGMP 24 h可使體外培養(yǎng)的血管肉瘤細胞分別減少36%、61%、30%、29%及32%，且可抑制68%～85%DNA合成。

甲狀腺髓樣癌（體外實驗）［19］:α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP 24 h可使體外培養(yǎng)的甲狀腺髓樣癌細胞分別減少71%、81%、66%及68%，在癌細胞數(shù)量減少的3 d內(nèi)未出現(xiàn)新的增生，心房肽類激素可以使DNA合成減少65%～84%。

胰腺癌（體外實驗及裸鼠體內(nèi)實驗）:體外實驗中［20］，初治無效的胰腺癌細胞對以0.1μmo L混合的4種心房肽類激素敏感，而正常肺、腎、前列腺及內(nèi)皮細胞則不受損傷，其作用機制是抑制胰腺癌細胞增殖。體內(nèi)裸鼠試驗［21］發(fā)現(xiàn)，與對照相比，通過血管每周兩次給α－h(huán) ANP、VD（濃度100μmo L），28 d后使人胰腺癌細胞生長速度分別減少68%和92%［21］。在人胰腺癌的裸鼠模型中連續(xù)28 d按體質(zhì)量皮下注射3 nmol/（min·kg）α－h(huán) ANP、VD、LANP及KP，可減少80%、33%、20%及14% 的胰腺癌細胞；治療后試驗組動物盡管沒有痊愈，但與對照組相比較，腫瘤體積減少10%。與原發(fā)性胰腺癌相比，轉(zhuǎn)移的胰腺癌動物NPR－A受體減少33%～55%［22］，其抗腫瘤機制是抑制裸鼠胰腺癌細胞細胞核內(nèi)DNA的合成。另一項免疫組化研究［8］發(fā)現(xiàn)，ANP來源的心房肽類激素在胰腺癌細胞的細胞質(zhì)和細胞核聚集，這與其在惡性腫瘤細胞中降低DNA合成的抗腫瘤作用一致，同時發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞中這項作用受到局限。此項研究將這些抑制生長的激素定位在細胞核中，它們在核內(nèi)抑制DNA的合成，且很可能與促進生長的激素相互干擾，這就是其在體內(nèi)、外抑制胰腺癌細胞生長的病因?qū)W［8］。

3 ANP的合成

3.1 化學(xué)合成

ANP來源的心房肽類激素可作為一種多肽類藥物在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮良好作用。然而目前僅美國南佛羅里達大學(xué)心臟激素中心開展了大量關(guān)于α－h(huán)ANP、VD、LANP及KP這4種心房肽類激素的抗腫瘤實驗。其原因主要是多肽合成不僅復(fù)雜而且十分昂貴，在實驗室研究中尚不能大規(guī)模推廣。

目前多肽大規(guī)模工業(yè)化制備絕大部分都靠化學(xué)合成，在多肽合成儀中采用固相、液相或液固并用的化學(xué)方法合成。多肽化學(xué)合成的每一步都要去掉其副產(chǎn)物。氨基酸序列長度越長，化學(xué)合成將越繁雜，副產(chǎn)物也將越多，繼而成本也將越高。另外，多肽生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的有機溶劑廢液（生產(chǎn)1 kg多肽藥物約產(chǎn)生1000 L有機廢液），對環(huán)境也會產(chǎn)生極大的污染。

3.2 ANP基因工程

基因工程生產(chǎn)心房肽類藥物應(yīng)該是一種產(chǎn)量大且相對廉價的方法，但尚在起步階段。多肽藥物基因工程合成困難的主要原因是多肽分子量較蛋白質(zhì)小，在細胞中表達后不穩(wěn)定，容易被降解。為了增加其穩(wěn)定性，可將多肽基因與載體蛋白質(zhì)基因結(jié)合，以融合蛋白的形式在原核系統(tǒng)或真核系統(tǒng)中表達，最后再切斷融合蛋白以獲得目的多肽。由于多肽在融合蛋白中所占比例小（1/10），因此產(chǎn)量較低。為提高獲得率，可考慮采用串聯(lián)多肽基因的方法，但其問題是融合蛋白的切斷無論是酶切或化學(xué)切斷都很困難。也可采用真核系統(tǒng)分泌型質(zhì)粒表達多肽的方法，對表達的蛋白質(zhì)進行翻譯后的加工和修飾，高密度發(fā)酵培養(yǎng)表達量高，但從大量培養(yǎng)基中回收目的多肽相當(dāng)困難。

已有研究［23］可用基因工程合成α－h(huán) ANP，但距大規(guī)模生產(chǎn)還有待時日。

4 展 望

隨著化學(xué)合成及基因工程合成ANP類多肽的進展，我們有望將其從實驗室的研究轉(zhuǎn)入實際的臨床試驗，這不僅為臨床腫瘤提供一種新的治療手段，而且這類多肽特定的生物學(xué)活性將使其給治療過程中所帶來的風(fēng)險遠遠低于目前的各種治療手段。

［1］Kisch B.Electron microscopy of the atrium of the heart.I.Guinea pig［J］.Exp Med Surg，1956，14（2－3）:99－112.

［2］de Bold AJ，Borenstein HB，Veress AT，et al.A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats［J］.Life Sci，1981，28（1）:89－94.

［3］Potter LR，Yoder AR，F(xiàn)lora DR，et al.Natriuretic peptides:their structures，receptors，physiologic functions and therapeutic applications［J］.Handb Exp Pharmacol，2009，（191）:341－366.

［4］Casserly B，Pietras L，Schuyler J，et al.Cardiac atria are the primary source of ANP release in hypoxia－adapted rats［J］.Life Sci，2010，87（11－12）:382－389.

［5］Vesely DL.Which of the cardiac natriuretic peptides is most effective for the treatment of congestive heart failure，renal failure and cancer［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33（3）:169－176.

［6］Skelton WP 4th，Pi GE，Vesely DL.Four cardiac hormones cause death of human cancer cells but not of healthy cells［J］.Anticancer Res，2011，31（2）:395－402.

［7］Vesely DL.Metabolic targets of cardiac hormones＇therapeutic anti－cancer effects［J］.Curr Pharm Des，2010，16（9）:1159－1166.

［8］Vesely DL.Cardiac and renal hormones:anticancer effects in vitro and in vivo［J］.J Investig Med，2009，57（1）:22－28.

［9］Sun Y，Eichelbaum EJ，Lenz A，et al.Epidermal growth factor＇s activation of Ras is inhibited by four cardiac hormones［J］.Eur J Clin Invest，2010，40（5）:408－413.

［10］Vesely BA，Song S，Sanchez－Ramos J，et al.Five cardiac hormones decrease the number of human small－cell lung cancer cells［J］.Eur J Clin Invest，2005，35（6）:388－398.

［11］Vesely DL，Vesely BA，Eichelbaum EJ，et al.Four cardiac hormones eliminate up to two－thirds of human breast cancers in athymic mice［J］.In Vivo，2007，21（6）:973－978.

［12］Sun Y，Eichelbaum EJ，Skelton WP 4th，et al.Vessel dilator and kaliuretic peptide inhibit Ras in human prostate cancer cells［J］.Anticancer Res，2009，29（4）:971－975.

［13］Sun Y，Eichelbaum EJ，Lenz A，et al.Atrial natriuretic peptide and long－acting natriuretic peptide inhibit ras in human prostate cancer cells［J］.Anticancer Res，2009，29（6）:1889－1893.

［14］Vesely BA，Eichelbaum EJ，Alli AA，et al.Four cardiac hormones cause cell death of melanoma cells and inhibit their DNA synthesis［J］.Am J Med Sci，2007，334（5）:342－349.

［15］Gower WR，Vesely BA，Alli AA，et al.Four peptides decrease human colon adenocarcinoma cell number and DNA synthesis via cyclic GMP［J］.Int J Gastrointest Cancer，2005，36（2）:77－87.

［16］Vesely BA，F(xiàn)itz SR，Gower WR Jr，et al.Vessel dilator:most potent of the atrial natriuretic peptides in decreasing the number and DNA synthesis of human squamous lung cancer cells［J］.Cancer Lett，2006，233（2）:226－231.

［17］Vesely BA，Eichelbaum EJ，Alli AA，et al.Four cardiac hormones eliminate 4－fold more human glioblastoma cells than the green mamba snake peptide［J］.Cancer Lett，2007，254（1）:94－101.

［18］Vesely BA，Alli A，Song S，et al.Primary malignant tumors of the heart:four cardiovascular hormones decrease the number and DNA synthesis of human angiosarcoma cells［J］.Cardiology，2006，105（4）:226－33.

［19］Eichelbaum EJ，Vesely BA，Alli AA，et al.Four cardiac hormones eliminate up to 82%of human medullary thyroid carcinoma cells within 24 hours［J］.Endocrine，2006，30（3）:325－332.

［20］Skelton WP 4th，Pi G，Lenz A，et al.Cardiac hormones inhibit proliferation of pancreatic cancer but not normal cells［J］.Eur J Clin Invest，2010，40（8）:706－712.

［21］Lenz A，Sun Y，Eichelbaum EJ，et al.Twice－weekly intravenous treatment of pancreatic cancer with atrial natriuretic peptide and vessel dilator［J］.In Vivo，2010，24（2）:125－129.

［22］Vesely DL，Eichelbaum EJ，Sun Y，et al.Elimination of up to 80%of human pancreatic adenocarcinomas in athymic mice by cardiac hormones［J］.In Vivo，2007，21（3）:445－451.

［23］Qin N，Wei N，Yao XH，et al.Synthesis and secretion of human atrial natriuretic peptide in Saccharomyces cerevisiae［J］.Sci China B，1991，34（12）:1478－1484.

Anticancer Effects of Atrial Natriuretic Peptide and Recombinant Expression of the Peptide

GAO Bo WU

Xiaoyan LU Yi Department of Geriatrics，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China

R730.5

A

上海市科委重點項目（編號:10431904000）

陸怡，E－mail:luyi＿2006＠efesco.com