劉麗萍 ，王 艷

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；）

無融合生殖（apomixis）是指通過種子進行繁殖的特殊的無性繁殖方式，產(chǎn)生的子代基因型與親本精確相同，因此能固定雜種優(yōu)勢，具有重要的應(yīng)用前景。我們于1988年開始進行栽培甜菜（B.vulgaris）與白花甜菜種間雜交，成功獲得了真實雜種，經(jīng)多次回交，首次在世界上獲得帶有無融合生殖特性的栽培甜菜帶有白花甜菜染色體的甜菜單體附加系系列，并利用顯微切割技術(shù)（Microdissection）在南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院已將白花甜菜染色體識別并分離，為進一步克隆無融合生殖基因提供優(yōu)質(zhì)材料［1－2]。

被子植物的雌配子體也稱胚囊［3]。無融合生殖甜菜M14胚囊位于子房、胚珠多層細胞下的深處，甜菜是厚珠心（6～7層）胚珠［4]，這給研究工作帶來很大的難度，致使研究手段受到了很大的限制。胚囊是雙受精及胚和胚乳發(fā)育的主要場所，因此具有重要的研究價值。申業(yè)等［5]對甜菜胚囊形成與發(fā)育的研究早有報道，但其傳統(tǒng)切片方法的制作過程相當繁冗，工作量較大，并且根據(jù)連續(xù)切片來建立立體概念也需要相當?shù)哪托呐c經(jīng)驗。為了尋求簡便而富于立體感的觀察胚囊的方法，我們在研究觀察甜菜胚囊壓片法及子房透明術(shù)觀察無融合生殖甜菜胚囊發(fā)育的基礎(chǔ)上，直接分離胚珠，并對胚珠進行再次切割和分離，直接保留珠孔端進行制片觀察，同時利用發(fā)育中的胚囊能產(chǎn)生自發(fā)熒光的特點，經(jīng)水楊酸甲酯（methylsalicylate，即冬青油）整體透明，用熒光顯微技術(shù)（fluorescence microscopy，F(xiàn)M）觀察甜菜胚囊，建立了一種快速簡便的分析甜菜胚囊發(fā)育的子房透明技術(shù)，以便從胚胎學(xué)角度整體觀察無融合生殖甜菜胚囊發(fā)育的變化機制。

1 材料和方法

1.1 材料

無融合生殖甜菜單體附加系M14（Beta vulgaris L.，VV＋1C、2n＝18＋1）是黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院甜菜課題組經(jīng)過十多年雜交培育的。試驗供試材料：栽培甜菜（Beta vulgaris L.）；非整倍體初級三體PT6（VV＋1C，2n＝18＋1）和帶有無融合生殖特性的野生種白花甜菜（Beta corolliflora ZOSS.，CCCC，2n＝4x＝36）1982 年引種于英國皇家植物園。

用PT6作為母本、白花甜菜為父本進行雜交，獲得了真實雜種（VVCC，2n＝36），利用PT6回交，獲得帶有白花甜菜的單體附加系系列，經(jīng)過細胞學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定表明：共獲得9種類型的單體附加系系列，其中M14株系為帶有白花甜菜第9號染色體的栽培型（Ⅸ）甜菜單體附加系，表明將帶有無融合生殖基因的一條白花甜菜染色體轉(zhuǎn)移到栽培甜菜（PT6）中，使原來只能進行有性生殖的栽培甜菜PT6可以高效表達無融合生殖特性［6]。

1.2 方法

1.2.1 整體透明 取不同發(fā)育時期的花序或花蕾［7]。用福爾馬林5mL＋丙酸5 mL＋50%乙醇90 mL混合固定液（FPA）或戊二醛（glutaraldehyde）（pH=7.0）固定液固定。在FPA中固定24h。在戊二醛中固定2～4h。之后分別換入70%乙醇，貯存在4℃冰箱中備用。材料固定后用10%濃度差的梯度乙醇系列脫水（每次15～20min），然后經(jīng)無水乙醇與冬青油（1∶1）混合液處理2次，每次處理1h。再轉(zhuǎn)入冬青油中透明，期間換液3次，前兩次每次4 h，最后一次處理1d。

1.2.2 整體染色 分別用蘇木精和硼砂洋紅對甜菜花序進行整體染色。經(jīng)試驗驗證硼砂洋紅效果更好。硼砂洋紅染色液的配制方法：首先取2～3g洋紅粉末加到100mL的4%的硼砂水溶液中，加熱，煮沸30min。然后將此液靜置3d后用等量的70%乙醇稀釋，再靜置24h后過濾備用。此液為核染劑。將試驗材料分別放在50mL的廣口瓶中，用硼砂洋紅整體染色4～5d。染色是在SQKC-Ⅲ生物制片快速處理儀中進行的（航空航天部蘭州飛控儀器總廠）。染色后用酸酒（100mL的70%乙醇中加入鹽酸3～5滴）處理，再用70%乙醇沖洗直到它呈現(xiàn)鮮艷透明的紅色（注：因前期的甜菜胚珠太小而以小花蕾進行處理，以免胚珠丟失）。用100%乙醇和鹽酸1∶1做解離液。解離時間短，解離程度好掌握。材料軟化程度以能壓散胚珠細胞為準。解離時間為5～10min，用蒸餾水沖洗2～3次。

1.2.3 胚珠剝離與切割 經(jīng)過透明及染色后的花序在解剖鏡下（x75201225G型）用光滑尖銳的解剖針按從小到大的順序剝離子房進而分離出胚珠，并對胚珠進行切割，只保留珠孔端大約1/3部分。由于甜菜胚珠非常小，經(jīng)過處理后易丟失，且處理過后的甜菜花序及胚珠都比較柔嫩，擠壓后常發(fā)生變形或破碎，為解決這些問題，試驗中采用凹載玻片代替普通載玻片。制片時將胚珠置于凹槽中央，進行切割和分離。

在分離切割后留下的試驗材料上滴一滴透明劑（乳酚甘油，其配方：乳酸20mL，酚20mL，甘油40mL，蒸餾水20mL）。如果胚珠染色不足，可在透明劑中加少許硼砂洋紅染色液利于觀察經(jīng)過透明后的植物細胞。

1.2.4 制片 胚珠透明染色2～3min后。蓋上蓋玻片進行壓片（切勿移動蓋片，以免細胞變形）。側(cè)重在已做過標記的珠孔方向輕輕敲擊，讓細胞分散并使細胞都處在同一平面內(nèi)，不重疊以便于觀察。 用丁香油（clove oil）封片。在OLYMPUS-BX51型熒光顯微鏡下通過熒光顯微鏡技術(shù)觀察和照相。

2 試驗結(jié)果

在OLYMPUS-BX51型熒光顯微鏡488nm波長熒光激發(fā)下，觀察發(fā)育中的胚囊顯示自發(fā)熒光，核仁的熒光十分明亮，細胞質(zhì)與核質(zhì)的熒光較弱，液泡無自發(fā)熒光。由于甜菜胚囊細胞的核仁比周圍胚珠組織細胞的核仁大，相比之下自發(fā)熒光使胚囊細胞的核仁十分明顯，從而有利于觀察和分析。

2.1 不同固定液及染色液的效果

用不同固定液固定的材料，在FM下差異明顯。FPA固定的材料雖然能觀察到胚囊的構(gòu)造，但層次不夠清晰，核仁的自發(fā)熒光較弱。相比之下，4%戊二醛固定的材料能清晰分辨出胚囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)，且層次分明，核仁自發(fā)熒光較強，其效果比FPA好。這可能是由于FPA固定液對細胞內(nèi)自發(fā)熒光物質(zhì)有破壞作用所致。

蘇木精和硼砂洋紅染色差異明顯，硼砂洋紅更適合于經(jīng)過透明之后的試驗材料，而蘇木精更適于石蠟切片。

經(jīng)過透明的試驗材料，在光鏡下觀察反差小，用相差鏡觀察效果好。如染色不足可沿著蓋玻片滴加硼砂洋紅進行再次染色。此方法對稍大或略成熟的胚珠也適用，而且更利于操作。只是在處理的時間上或長或短略有不同。用解剖鏡和普通光學(xué)顯微鏡即可進行分離和觀察。一般實驗室都可做到。

2.2 甜菜胚囊發(fā)育過程的觀察

利用上述試驗程序，可快速清晰地觀察分析無融合生殖甜菜M14胚囊發(fā)育的各個階段。研究表明在胚珠珠孔端，珠心表皮下有一個細胞分化為初生孢原細胞，其平周分裂形成初生周緣細胞和初生造孢細胞，周緣細胞進行多次平周分裂形成厚珠心胚珠，造孢細胞直接發(fā)育成大孢子母細胞。其特點是細胞變大、細胞質(zhì)濃、細胞核大，細胞形狀為橢圓形。單核胚囊的核隨著發(fā)育逐漸由胚囊一端向胚囊中心移動進行第一次有絲分裂，之后向兩極移動形成二核胚囊。其形態(tài)變得細而長，二核期胚囊的中間部位分化出1個大液泡，將兩個子核及胞質(zhì)分別隔在胚珠珠孔端及合點端。隨著胚囊的發(fā)育進而形成四核胚囊、八核胚囊。最終發(fā)育為成熟胚囊。珠孔處看不到花粉管，胚囊沒有發(fā)生受精作用。2個退化助細胞的自發(fā)熒光很強，這可能是由于胼胝質(zhì)在退化細胞的細胞壁積累所致。成熟胚囊：可清晰分辨出內(nèi)部構(gòu)造，即靠近合點端及珠孔端各有3個核，胚囊中部有2個核。珠孔端3個組成卵器，2個助細胞提前退化。合點端3個形成3個反足細胞。成熟胚囊：半數(shù)卵細胞的極性與正常卵細胞相反。卵細胞與次生核不經(jīng)受精而自行分裂，產(chǎn)生無性胚。表明甜菜單體附加系M14是以二倍孢子體無融合生殖為主要繁殖方式，有性生殖為次要繁殖方式的兼性無融合生殖體。雌配子體發(fā)育遲緩且有胚囊敗育的情況發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)正常發(fā)育的雌配子體只占總數(shù)的1/4，這也驗證了無融合生殖甜菜單體附加系M14具有出苗率低和結(jié)實率低的特性。

3 討論

胚囊的結(jié)構(gòu)和功能是植物生殖生物學(xué)研究的一個重要方面。到目前為止，先后提出過許多觀察胚囊的技術(shù)：如Young等報道的適用于禾本科植物的雌蕊透明術(shù)、觀察甜菜胚囊的壓片法、整體解剖、整體透明、酶法分離、染色-透明等技術(shù)，石蠟切片是植物胚胎發(fā)生研究的基本方法，但存在費時費力等問題。整體透明技術(shù)是20世紀70年代發(fā)展起來的一項技術(shù)［8-10]，與傳統(tǒng)切片法及酶法分離等技術(shù)相比，此技術(shù)的優(yōu)點是能快速簡捷觀察植物胚囊，目前在植物胚胎學(xué)中已得到廣泛應(yīng)用。整體透明術(shù)所使用的透明劑主要是混合透明劑和冬青油透明劑。與混合透明劑相比，冬青油透明效果更佳。不僅可用于胚珠，也可用于子房的透明。我們采用了雌蕊透明術(shù)與壓片法相結(jié)合，制片過程簡單快速，可獲得富于立體感的三維圖像。通過剝?nèi)∨咧椴Ψ蛛x出來的胚珠進行再次切割只保留珠孔端。采用胚珠透明術(shù)，利用水楊酸甲酯（冬青油）透明，Olympus CH型熒光顯微鏡觀察，獲得較好的試驗結(jié)果。

Christensen等［11]利用發(fā)育中的胚囊能產(chǎn)生自發(fā)熒光，經(jīng)苯甲酸芐脂（benzyl benzoate）和芐醇（benzyl alcohol）（2∶1）混合透明劑透明，用熒光顯微鏡觀察胚珠小且無子房壁的擬南芥（Arabidopsis thaliana）胚珠發(fā)育獲得了很好的效果。在此基礎(chǔ)上我們用甜菜子房做材料，分離出胚珠，并以價格便宜易于獲得的冬青油代替苯甲酸芐脂和芐醇做透明劑，進行無融合生殖甜菜M14胚囊發(fā)育的觀察，試驗表明這項技術(shù)對于甜菜子房及胚珠同樣適用。

該項技術(shù)具有如下顯著優(yōu)點：（1）程序簡單，材料制作僅需固定、脫水、透明、胚珠分離四步即可完成。（2）借助于熒光顯微鏡，無需復(fù)雜的試驗過程、較大的工作量及費時費力的傳統(tǒng)切片。（3）利用發(fā)育中的胚囊產(chǎn)生自發(fā)熒光，無需熒光染料染色。（4）通過對胚珠的分離和切割使試驗效率大大提高?？焖偈r省力，材料準備及分析僅需幾天即可完成。

利用透明和熒光顯微鏡技術(shù)，用本試驗方法在觀察分析無融合生殖甜菜胚囊發(fā)育過程及胚囊敗育情況時雖有快速簡便的優(yōu)點，但也有其不足之處。在FM下，胚囊細胞中的核仁顯示明亮的熒光易于觀察和分辨，卵細胞結(jié)構(gòu)清晰易于識別，助細胞提前退化，反足細胞僅能從核和已認識的結(jié)構(gòu)做出判斷，胚囊細胞及細胞核的結(jié)構(gòu)輪廓不夠清晰，較難分辨，若從觀察胚囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)細節(jié)的清晰度考慮，本實驗方法不如傳統(tǒng)切片效果，在光鏡下觀察反差小，適于相差鏡觀察。因此不適用于研究胚囊發(fā)育的結(jié)構(gòu)細節(jié)變化。

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