許燁燁 王威 蔣馥蔓 叢林＊

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽 合肥 230022；2．深圳華大基因研究院，廣東 深圳 518083）

Turner綜合征又稱先天性卵巢發(fā)育不全，是最常見的性染色體非整倍體疾病，在新生女嬰中的發(fā)病率約為1／2500。該病在活產(chǎn)中核型為45，XO約占55%，嵌合體約為15%，結(jié)構(gòu)重排的染色體約為25%，Y染色體存在的為5%［1］。Turner綜合征的主要臨床表現(xiàn)為身材矮小、原發(fā)性閉經(jīng)、第二性征不發(fā)育、性腺發(fā)育不良、頸蹼、面容異常（眼瞼下垂、后發(fā)際低等），常合并多種骨骼畸形。胎兒Turner綜合征多在產(chǎn)前經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)異常，超聲診斷該病的依據(jù)為頸后囊性淋巴管瘤、全身水腫及漿膜腔積

＊通訊作者：叢林，E－mail：conglin1957＠163．com液，但因其缺乏特異性，加之超聲檢查尚不能顯示胎兒卵巢，進(jìn)一步確診則依賴于細(xì)胞遺傳學(xué)或分子診斷的方法。我們結(jié)合超聲、染色體核型分析及胎兒羊水染色體核型分析產(chǎn)前診斷Turner綜合征1例，報道如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 孕婦，28歲，G1P0，孕19＋5周，孕3月曾感冒，未服藥自愈。夫妻體格發(fā)育及智力均無明顯異常，均無畸形陽性家族史。產(chǎn)前診斷超聲所見：胎兒雙頂徑34 mm（16＋4周），頭圍 118 mm（15＋6周），腹圍120 mm（17＋5周），肱骨長16 mm，股骨長16 mm（14＋6周），胎盤位于子宮前壁，厚25 mm，成熟度0級。胎心率154次／分，律齊，臍動脈2根，羊水平段34 mm。頭顱光環(huán)完整，腦中線居中，腦室未見擴(kuò)張，小腦橫徑9 mm。胎兒上唇線連續(xù)，眼鼻存在。脊柱連續(xù)完整，胸腹壁連續(xù)，心臟顯示欠清晰。四肢長骨存在，胃泡、膀胱、雙腎存在。胎兒頸部掃及51 mm×58 mm液暗區(qū)，內(nèi)見分隔。全身皮下軟組織增厚，最厚達(dá)3．6 mm，雙側(cè)側(cè)腦室寬7．4 mm，雙側(cè)胸腔掃及少量游離液暗區(qū)（圖1）。超聲提示：①宮內(nèi)妊娠，單活胎；②胎兒頸部淋巴水囊瘤；③胎兒全身皮下軟組織水腫；④胎兒雙側(cè)側(cè)腦室稍增寬；⑤雙側(cè)胸腔少量積液?；颊呒凹覍僖笠a(chǎn)并于產(chǎn)前診斷中心咨詢病因，于入院第3天行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水行胎兒染色體核型分析，隨后行“羊膜腔內(nèi)利凡諾注射引產(chǎn)術(shù)”。羊膜腔穿刺術(shù)前抽取孕婦外周血5ml置EDTA抗凝管供母血胎兒DNA檢測。引產(chǎn)后詳細(xì)檢查胎兒證實超聲診斷。

圖1 胎兒頸部見51 mm×58 mm液暗區(qū)，內(nèi)見分隔；雙側(cè)胸腔少量液性暗區(qū)

1．2 實驗方法

1．2．1 染色體核型分析 將抽取的羊水以2000 r／min，10 min離心后棄上清，加入培養(yǎng)基 （Amino MAX II Complete Medium，GIBCO，美國）7 ml，重懸后分裝2個培養(yǎng)瓶，10天后換液，11天后收獲細(xì)胞，常規(guī)方法低滲、預(yù)固定、反復(fù)固定后滴片染色，100＊油鏡下觀察。

1．2．2 無創(chuàng)基因檢測

1．2．2．1 血漿DNA提取 將孕婦外周血5 ml在4℃條件下以1600 g，10 min離心后取上清，再將上清液以16 000 g，10 min離心后所得上清即為血漿，使用QIAGEN公司提供的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取血漿游離DNA，按說明書操作。

1．2．2．2 大規(guī)?；虿⑿袦y序 因母體血漿中DNA已經(jīng)是片段化的，故無需進(jìn)一步的片段化，將提取的游離DNA通過新一代Illumina Hiseq2000測序儀（深圳華大基因研究院提供）進(jìn)行大規(guī)模基因并行測序，通過測序可以獲得約百萬條短DNA序列讀本。

1．2．2．3 生物信息學(xué)處理 生物信息學(xué)分析軟件為有效的大規(guī)模核算數(shù)據(jù)庫比對軟件（ELAND），通過此分析軟件將所測DNA序列和人類參考基因組進(jìn)行比對，這一比對的目的是確定所測血漿DNA片段的染色體來源，然后計數(shù)每一染色體來源的序列數(shù)量（僅計算能唯一匹配到該條染色體上的序列），計算血漿樣本中每一染色體序列數(shù)目與總?cè)旧w序列數(shù)目之和的比率%chr N，進(jìn)一步計算所檢測樣本的Z值（T－score），Z值指的是偏離于參考數(shù)據(jù)組均值的多少個標(biāo)準(zhǔn)差，即

正常孕婦Z值的99%置信區(qū)間為 ［－3，3］，對于孕有非整倍體如21三體胎兒的孕婦因血漿中含比正常女性胎兒多的微量DNA而顯示Z值偏高，以Z值大于3為分隔值來判斷胎兒是否為21三體；而X單體因血漿中含比正常女性胎兒少的微量DNA而顯示Z值偏低，以Z值小于（－3）為分隔值來判斷胎兒是否為X單體。

2 結(jié)果

2．1 無創(chuàng)基因檢測結(jié)果 孕婦血漿DNA樣本經(jīng)測序后比對及生物信息學(xué)分析顯示X染色體Z值＜－3，在參考值范圍［－3，3］之外，無Y染色體序列，其余1～22號染色體的Z值均在［－3，3］區(qū)間之內(nèi)，提示胎兒X染色體偏少，考慮胎兒核型45，XO。結(jié)果與之后報告的染色體核型分析結(jié)果相符，送檢標(biāo)本至報告時間為10天（圖2）。

2．2 染色體核型分析結(jié)果 羊水細(xì)胞染色體核型為45，XO［20］，確診為Turner綜合征（圖3）。

2．3 引產(chǎn)后檢查結(jié)果 引產(chǎn)后詳細(xì)觀察，為一女性死胎，胎兒大小與妊娠月份相符，頭皮、全身皮膚除手心、腳心外均水腫，頸后部水腫呈囊狀。

圖2 該孕婦及其他10例血漿樣本檢測的Z值，紅色表示該孕婦的結(jié)果

圖3 胎兒染色體核型分析結(jié)果

3 討論

胚胎染色體核型為45，XO者占所有孕胚的1%～2%，其中99%發(fā)生流產(chǎn)，而1%左右能夠存活的具體原因尚不明確［2］，Turner綜合征是惟一能夠存活的染色體單體疾病，可在產(chǎn)前得以診斷進(jìn)行相關(guān)干預(yù)。

目前，胎兒染色體非整倍體的檢查包括初期篩查評估風(fēng)險值，對于高風(fēng)險人群需進(jìn)一步確診，胎兒細(xì)胞核型分析是產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，卻是以侵入性的方式獲取胎兒細(xì)胞因而有流產(chǎn)及感染的風(fēng)險，加之細(xì)胞培養(yǎng)周期長，孕婦等待結(jié)果的過程心里負(fù)擔(dān)重，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)一直是人們美好的愿望。

1997年，孕婦外周血中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷打開了新的篇章［3］。然而，孕婦外周血中的胎兒游離DNA分子在總游離DNA分子中的比例相對小，僅占3%～6%，分離和檢測胎兒游離DNA分子有一定難度。目前研究多集中于兩個方面：①表觀遺傳學(xué)方法尋找胎兒特異標(biāo)記物；②高通量基因測序檢測胎兒非整倍體。本文病例我們應(yīng)用高通量測序的方法對孕婦外周血中游離DNA進(jìn)行全基因組測序，得出胎兒染色體為45，XO，與核型分析結(jié)果一致。

高通量測序技術(shù)能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，利用孕婦外周血游離DNA進(jìn)行高通量測序及后續(xù)的生物信息學(xué)比對分析，能夠準(zhǔn)確地確定某一染色體序列數(shù)目的變化，定量的測定母體血漿中DNA分子的微小變化，用于胎兒染色體非整倍體的檢測。最初主要集中于21三體胎兒的研究，2008年 Chiu和 Fan［4，5］兩個研究小組首次證實了應(yīng)用母體血漿DNA行大規(guī)?；虿⑿袦y序檢測胎兒21三體的可行性，后期通過大規(guī)模臨床研究驗證其臨床有效性和實際可行性。Chiu等［6］分析753名接受過核型分析確診的21三體高風(fēng)險孕婦，其中86名懷有21三體胎兒，對孕婦血漿DNA分子進(jìn)行大規(guī)模基因并行測序，21三體胎兒檢測的敏感性為100%，特異性為97．9；Ehrich等［7］同樣分析449名孕婦，21三體胎兒檢測的敏感性為100%，特異性為99．7%。Palomaki GE等［8，9］分析212例21三體孕婦及1484例對照組，敏感性為98．6%，假陽性率為0．2%。同樣的方法理論上還可以檢測18三體、13三體、Turner綜合征（45，X）、克氏綜合征（47，XXY）等，但因臨床樣本較少，目前的研究還達(dá)不到21三體的檢測效率。本研究我們僅對1例特納氏綜合征進(jìn)行了平行測序，X染色體的Z值位于正常區(qū)間之外，說明該樣本外周血中X染色體含量低于正常孕婦，提示胎兒缺失一條X染色體，得出的結(jié)果與核型分析一致，出結(jié)果時間明顯快于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，體現(xiàn)了此項檢查的優(yōu)越性，但有研究對高危人群的平行測序結(jié)果顯示，該方法對性染色體的檢測敏感性不高，所以需積累更多病例和改善檢測技術(shù)才能有效應(yīng)用于臨床。近期，Bianchi等［10］應(yīng)用高通量測序技術(shù)對532份母體血漿DNA樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示21、18、13三體、X單體檢測的敏感性分別為100%、97．2%、78．6%、93．8%，結(jié)果令人鼓舞。

為了提高檢測效能，有研究者分析了影響檢測準(zhǔn)確性的因素包括DNA片段GC含量、測序深度、生物信息學(xué)分析方法等，他們對分析過程加以改進(jìn)，用連接測序代替合成測序法［11］，或信息學(xué)分析過程對高GC含量片段進(jìn)行加權(quán)以減少GC偏倚［12］，通過增加非重復(fù)序列讀本數(shù)量加大測序深度［13］等，并加以臨床驗證，有效地提高了檢測的準(zhǔn)確性，且使檢測范圍擴(kuò)展到每一條染色體。Amy J．Sehnert等［14］認(rèn)為測序過程每次運行及每次運行各通道之間存在變異，為了盡量減少此變異，作者采用了一種新算法，用標(biāo)準(zhǔn)化的染色體值 （NCVs）檢測每一染色體異常，在48例實驗組中以100%準(zhǔn)確率檢測出21三體（13／13）和18三體（8／8），檢出1例13三體（1／2），檢出2例 X 單體（2／3），未檢出者均位于臨界區(qū)間，正常核型胎兒性別均得到正確預(yù)測。應(yīng)用此算法對雙胎中至少有一胎為21三體的母體血漿樣本進(jìn)行檢測，均得以正確檢測得到，此為首次報道。

利用新一代高通量測序技術(shù)對孕婦外周血中游離的DNA進(jìn)行測序來檢測胎兒染色體非整倍體異常，具有無創(chuàng)、早期、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，在孕周12周以上的孕婦，只需要抽取5ml母體外周血即可進(jìn)行檢測，7天出檢測報告，有較高的敏感性與特異性，避免了胎兒宮內(nèi)感染和流產(chǎn)的風(fēng)險，極大的降低了孕婦及家屬的心理擔(dān)憂，能盡早提供產(chǎn)前診斷信息有助于病人及家屬早做干預(yù)性決定。該項技術(shù)還在進(jìn)一步研究中，隨著大規(guī)模臨床試驗的驗證，有望代替侵入性的產(chǎn)前診斷方法，代表了當(dāng)前產(chǎn)前診斷和防止先天性缺陷兒出生的最新發(fā)展方向。本文結(jié)果也證實了基因測序技術(shù)診斷染色體非整倍體異常是可行的，其無創(chuàng)性及快速性也正是產(chǎn)前診斷所追求的目標(biāo)。但是，此方法畢竟未獲取純胎兒遺傳信息，結(jié)果受多種因素影響，目前不能作為診斷，而只能作為一種篩查方法，了解非整倍體異常情況發(fā)生的風(fēng)險高低，因其費用較高，難以臨床大規(guī)模普及。應(yīng)用外周血游離DNA進(jìn)行無創(chuàng)性的產(chǎn)前診斷仍需更多的探索。

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