鄒剛剛，陳永久，吳常文

（浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316004）

分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用促進(jìn)了動物遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)的發(fā)展。在一系列的分子標(biāo)記當(dāng)中，由于操作方便，信息量多等原因，微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記近年來被廣泛使用。盡管如此，一種新的分子標(biāo)記，SNP（single nucleotide polymorphisms），即單核苷酸多態(tài)性，它的出現(xiàn)卻吸引了研究者的目光，受到了更多人的歡迎[1]。

SNP是指單個核苷酸發(fā)生改變而引起的DNA序列的多態(tài)性，最早在1996年由LANDER[2]提出來的。SNP所表現(xiàn)出的多態(tài)性是由于單個堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失所導(dǎo)致的。由于CpG二核苷酸上的胞嘧啶殘基容易自發(fā)脫氨形成胸腺嘧啶，所以轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率最高，約占全部變異的2/3，而且三或四等位的SNP幾乎沒有，因此通常我們所說的SNP為二等位多態(tài)性[3]。

在染色體中，DNA的突變是隨機(jī)的，任何的堿基都有可能發(fā)生突變。SNP在基因組中分為兩類，一類發(fā)生在編碼區(qū)當(dāng)中，又叫cSNP，另一類發(fā)生在非編碼區(qū)當(dāng)中。HALUSHKA等[4]根據(jù)對75個基因的檢測推測人類基因組的SNP位點大概有100萬個，其中一半以上存在于非編碼區(qū)，1/5-2/5存在于編碼區(qū)當(dāng)中。非編碼區(qū)的SNP對于蛋白質(zhì)的合成沒有直接的影響，但可能在種群遺傳進(jìn)化及其相關(guān)方面有作用[5]。而編碼區(qū)的SNP可能對生物后代的遺傳性狀產(chǎn)生一定的影響，據(jù)此又可分為同義SNP和非同義SNP。同義SNP對蛋白質(zhì)的合成沒有什么影響，而非同義SNP會改變蛋白質(zhì)的意義。研究表明20%左右的非同義cSNP會導(dǎo)致合成蛋白質(zhì)意義發(fā)生變化[6]，這種變化可能直接導(dǎo)致生物性狀發(fā)生改變。由于單核苷酸的差別，導(dǎo)致了個體間的差異。對這些差異的研究有助于了解不同種群的個體生長狀態(tài)，對疾病的抵抗能力，以及對環(huán)境的適應(yīng)能力，進(jìn)而應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中，具有非常重要的意義。

1 SNP的檢測

到目前為止，傳統(tǒng)檢測SNP的的技術(shù)和方法已有很多種，例如DNA測序、RFLP、AFLP等。隨著技術(shù)的進(jìn)步，各種新型的檢測SNP的技術(shù)也在不斷的出現(xiàn)，如，RRS、質(zhì)譜分析、DHPLC等。每種方法都有其不同的特點，以下簡要介紹幾個比較典型的檢測方法。

1.1 DNA sequencing

DNA sequencing即DNA測序是檢測SNP最直接的方法。最早的測序方法是SANGER和COULSON發(fā)明的“加減法”[7]。主要原理是對不同個體的相同基因片段進(jìn)行測序，最后進(jìn)行比對和分析，利用該方法檢測SNP位點。1977年SANGER等[8]提出了雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA測序。SANGER的方法精確度高，但費(fèi)用昂貴。目前最新的DNA測序技術(shù)正朝向高效率、低成本的方向發(fā)展。2009年P(guān)USHKAREV等[9]利用Heli scope單分子測序儀[10]用了4個星期對1名白人男子的基因組進(jìn)行測序，測序范圍覆蓋了90%的人類參考基因組，鑒定出了280萬個SNP位點。

1.2 MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS，即基質(zhì)輔助激光解吸-離子化飛行時間質(zhì)譜分析法?；驹硎菍⒋郎y樣本與一定量的基質(zhì)化合物混合，利用基質(zhì)吸收激光的能量，將能量傳遞給待測樣本，使得待測樣本離子化，該過程不會引起待測樣本斷裂，離子化的樣本在質(zhì)譜儀中加速、檢測，最后根據(jù)樣本的質(zhì)量比進(jìn)行分型。PARACCHINI等[11]利用MALDI-TOF MS技術(shù)對人類的Y染色體進(jìn)行SNP的分型，精確度100%。目前該方法主要用于已知SNP的分析，對于未知SNP的分析還處于探索階段，不過KREBS等[12]利用MALDI建立了一種尋找新的SNP的方法，具有高通量，速度快等優(yōu)點。

1.3 DHPLC

目前，變性高效液相色譜（Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）的技術(shù)也應(yīng)用SNP位點的檢測中?；驹硎菍⒋郎y樣品與對照DNA混合，加熱使其變性，然后退火，利用DNA帶負(fù)電荷的性質(zhì)，將重新合成的DNA混合物吸附在固定相上，若重新合成的DNA混合物中存在變異位點，根據(jù)Tm值的不同，具有變異位點的雜合雙鏈比同源雙鏈更容易被洗脫下來，從而進(jìn)行分離。DHPLC技術(shù)是由OEFNER等[13]在1995建立起來的，具有敏感性和特異性高，自動化程度強(qiáng)等優(yōu)點，但其檢測結(jié)果受PCR產(chǎn)物、洗脫溫度、固定相和流動相等因素的影響。

1.4 RFLP

RFLP技術(shù)（Restriction fragment length polymorphism,限制性片段長度多態(tài)性），DNA限制性內(nèi)切酶能夠?qū)NA的特定位點進(jìn)行酶切，如果該酶切位點發(fā)生堿基的替換，則內(nèi)切酶則不能對該酶切位點進(jìn)行酶切，或者其它的某個位點發(fā)生變化，導(dǎo)致產(chǎn)生該酶切位點，這都會導(dǎo)致最后酶切片段的數(shù)目和大小發(fā)生變化，從而呈現(xiàn)出DNA多態(tài)的現(xiàn)象。SNP導(dǎo)致限制酶切位點的產(chǎn)生或消除，然后可以通過相應(yīng)的酶切和電泳加以檢測SNP的存在。該方法簡便，快速，但是只適合少量SNP的檢測[14]。

1.5 SSCP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP，Single-strand conformational polymorphism），對待測DNA片段進(jìn)行變性處理，然后在非變性的條件下進(jìn)行電泳，變性后的DNA單鏈由于堿基間的相互作用或形成一定比較穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)。如果存在SNP位點，形成的折疊結(jié)構(gòu)的構(gòu)象則會有所不同。通過電泳時不同構(gòu)象的DNA電泳遷移率不同檢測SNP，檢測效率在70%～90%以上[15]。HE等[16]利用SSCP方法對牙鲆的細(xì)胞色素P450-c19a基因進(jìn)行SNP檢測分析，找到了3個SNP位點。

1.6 RRS

約化表示散彈槍式排序法（Reduced representation shotgun sequencing,RRS）是美國ALTSHULER等[17]于2000年提出的。RRS方法可用于未知SNP的分析，利用該方法，ALTSHULER等檢測出人類基因組中47 172個SNP位點。隨后OLSEN等[18]對環(huán)斑海豹Phoca hispida進(jìn)行了種群遺傳學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)了768個SNP位點。RRS技術(shù)具有檢測速度快、便宜等優(yōu)點，可用于水產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)中的重要物種的SNP遺傳圖譜的構(gòu)建。

1.7 基因芯片

基因芯片，又稱DNA微陣列也是利用DNA雜交的原理建立起來的?；驹硎峭ㄟ^將大量特異的寡核苷酸序列探針固定在支持物上，然后與待測樣本進(jìn)行雜交，通過檢測、分析雜交信號，獲得SNP位點相關(guān)信息。BURTON等[19]利用基因芯片，對患者與健康者進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)在4種疾病中兩者的基因組存在一定的SNP位點差異，對于這些疾病的治療具有一定的應(yīng)用意義。MOHAMMAD等[20]利用SNP芯片，對膀胱癌患者進(jìn)行了SNP全基因組分析，具有一定的應(yīng)用價值?；蛐酒夹g(shù)具有高度集成化、自動化、信息量大，但是費(fèi)用高。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面應(yīng)用很少，還需要不斷對其不斷改進(jìn)。

2 SNP與微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的對比

目前，分子標(biāo)記作為動物遺傳學(xué)當(dāng)中不可或缺的一部分，它們的出現(xiàn)主要是靠不斷發(fā)展的分子生物技術(shù)。研究者根據(jù)自身研究需求不同，而采用不同的分子標(biāo)記技術(shù)。SNP作為一種最新的分子標(biāo)記技術(shù)，出現(xiàn)在微衛(wèi)星之后，有必要對它們進(jìn)行一定的比較和總結(jié)，從而為研究者從事科學(xué)研究時提供一定的參考。

微衛(wèi)星主要是指在基因組序列中具有一定的簡單的串聯(lián)的重復(fù)序列，因此又稱短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列，一般小于10 bp。微衛(wèi)星最早發(fā)現(xiàn)可以追溯至上個世紀(jì)70年代SKINNER等[21]的研究中，1992年GOOF等[22]對斑馬魚Brachydanio rerio基因組中的簡單重復(fù)序列進(jìn)行了研究。由于微衛(wèi)星技術(shù)具有多態(tài)性高、可自動檢測、數(shù)量多等特點，因此廣泛被應(yīng)用于個體識別、親本鑒定、基因組作圖、物種的遺傳多樣性研究等領(lǐng)域當(dāng)中。

SNP標(biāo)記技術(shù)繼微衛(wèi)星技術(shù)之后出現(xiàn)的新一代分子標(biāo)記具有更多的優(yōu)點，主要在以下幾個方面。首先，SNP是單個核苷酸發(fā)生改變，突變率小，相對于微衛(wèi)星片段遺傳穩(wěn)定性更高[23]。其次，SNP數(shù)目多，大約1 000 bp左右就會有1個SNP突變位點，而每15 kb才會有一個微衛(wèi)星位點[24]，因此更有利于復(fù)雜遺傳性狀的分析，例如物種遷移，親本鑒定[25]等。還有，在檢測時，微衛(wèi)星標(biāo)記需要進(jìn)行片段長度的檢測，而SNP基本上為二等位基因變異，只需要進(jìn)行簡單的“+/-”或“有/無”的分析，因此SNP更便于高通量的檢測和分析[26]。

然而，SNP大多數(shù)是二等位基因型變異，多態(tài)性比微衛(wèi)星標(biāo)記低。另外，對于一些單個位點的檢測，例如離群值的選擇位點檢測，多等位的微衛(wèi)星標(biāo)記則比SNP標(biāo)記有明顯的優(yōu)勢[27]。另外在個體鑒定當(dāng)中，單個SNP標(biāo)記鑒定效果比多等位基因標(biāo)記小2～4倍，但對于小于60～80 bp的PCR產(chǎn)物的單管重復(fù)檢測中，SNP將會提供更有效的檢測效果[28]。雖然SNP標(biāo)記存在一定的缺陷，但由于其遺傳穩(wěn)定性比其它標(biāo)記高，而且具有高通量、高密度和便于自動化分析等優(yōu)點，所以SNP被認(rèn)為是微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)之后的分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展方向[29]。

3 SNP在魚類養(yǎng)殖方面的應(yīng)用

3.1 遺傳圖譜的構(gòu)建

遺傳圖譜指是基因或分子標(biāo)記在染色體上呈線性排列。遺傳圖譜可以對一些重要經(jīng)濟(jì)性狀和QTL進(jìn)行定位,最終為實際應(yīng)用打下基礎(chǔ)。另外構(gòu)建高密度的遺傳圖譜可以推動標(biāo)記輔助選育和分子育種的發(fā)展，以及相關(guān)物理圖譜的構(gòu)建。

目前，應(yīng)用比較廣泛的是利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記構(gòu)建第二代遺傳圖譜，已經(jīng)在斑馬魚[30]、羅非魚Oreochromis spp.[31]和虹鱒魚Oncorhynchus mykiss[32]上進(jìn)行了一定的研究，但仍然不是理想的基因作圖的手段。微衛(wèi)星技術(shù)的主要缺陷就是檢測手段的自動化程度不高，對于超過10個位點的單個反應(yīng)的檢測有困難。而且微衛(wèi)星標(biāo)記在基因組中的數(shù)量不多，尋找這些標(biāo)記比較耗時，尤其是高通量的位點需要分析的時候[33]。另外微衛(wèi)星標(biāo)記不適于關(guān)聯(lián)性分析，原因在于不同的物種可能出現(xiàn)片段大小相等的微衛(wèi)星等位標(biāo)記，也有可能在相同的物種中出現(xiàn)片段大小不同的微衛(wèi)星標(biāo)記，造成分析的困難[34]。因此需要發(fā)展新一代的基因圖譜。

做為第三代分子標(biāo)記，SNP具有數(shù)目多，遺傳穩(wěn)定性高和易于檢測等優(yōu)點。雖然SNP相對于微衛(wèi)星的變異更少，并且需要更多的位點信息來構(gòu)建遺傳圖譜。然而SLATE[35]進(jìn)行的模擬研究表明，在典型家系的野生群體當(dāng)中，SNP在基因位點距離在2 cm或間隔更大的情況下，SNP構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜精度和準(zhǔn)確率更高。目前SNP遺傳圖譜主要應(yīng)用于一些模式生物。WANG等[36]第一次構(gòu)建了人類SNP遺傳圖譜；CHO等[37]對擬南芥Arabidopsis thaliana進(jìn)行了SNP遺傳圖譜的構(gòu)建；PETKOV等[38]對小鼠的SNP遺傳圖譜的進(jìn)行了研究。水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，STICKNEY等[39]利用SNP和寡核苷酸微陣列技術(shù)對斑馬魚的基因組進(jìn)行了分析，獲得了第一個斑馬魚的SNP遺傳圖譜。此外，利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)可將物理圖譜與遺傳圖譜進(jìn)行一定的結(jié)合[40]。

3.2 在進(jìn)化生物學(xué)和生態(tài)學(xué)中的研究

自然界中物種的進(jìn)化以及種群的多樣性直接與基因組DNA的突變相關(guān)，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖當(dāng)中，種質(zhì)資源的好壞直接關(guān)系到了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此亟需對養(yǎng)殖物種的種質(zhì)資源進(jìn)行合理的利用和保護(hù)。近年來隨著SNP技術(shù)的廣泛發(fā)展，研究者們意識到SNP能夠解決很多物種在進(jìn)化生物學(xué)和生態(tài)學(xué)當(dāng)中棘手的問題[41-43]。近年來，這方面的研究為種質(zhì)資源的利用和保護(hù)提供了一定的應(yīng)用基礎(chǔ)。相對于其他分子標(biāo)記技術(shù)，SNP分子標(biāo)記能夠提供更好的數(shù)據(jù)分析結(jié)果[44]，在遺傳多樣性以及相關(guān)物種進(jìn)化研究方面有著十分重要的作用。

3.3 個體識別和親緣關(guān)系鑒定

長期的自然和人工選擇，物種的基因型發(fā)生了一定改變，從而形成了不同的種群結(jié)構(gòu)。對于類似群體的研究，有利于了解群體的分布，這對于養(yǎng)殖具有重要的意義。傳統(tǒng)的分類手段主要依靠其表形特征，困難大，準(zhǔn)確性不高。而表形特征主要是遺傳物質(zhì)后期表達(dá)出的結(jié)果，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以計算不同物種的遺傳距離以及相似度。KARLSSON等[45]對大西洋鮭魚Salmo salar的7 000個SNP位點進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60個位點可用于野生和養(yǎng)殖群體的鑒別；SMITH等[46]通過10個SNP位點區(qū)分了兩個不同流域的大鱗大麻哈魚Oncorhynchus tshawytscha；通過SNP和微衛(wèi)星標(biāo)記對養(yǎng)殖和野生的大西洋鮭進(jìn)行研究，RENGMARK等[47]發(fā)現(xiàn)可以利用這些標(biāo)記對養(yǎng)殖和野生的群體進(jìn)行分離鑒定。

3.4 遺傳多樣性和種質(zhì)資源保護(hù)

遺傳多樣性是衡量一個種群種質(zhì)資源質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，遺傳多樣性的降低會影響群體的生存和適應(yīng)能力，從而導(dǎo)致種質(zhì)的衰退，影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。另外人為破壞自然環(huán)境，過度捕撈，也會導(dǎo)致了一些群體的種質(zhì)資源和遺傳多樣性的破壞，一些優(yōu)良性狀消失，不利性狀產(chǎn)生。通過分子標(biāo)記技術(shù)對野生和養(yǎng)殖群體進(jìn)行相關(guān)研究，有利于種質(zhì)資源的保護(hù)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。CREELMAN等[48]通過對19個群體中的2 013個大西洋鮭魚個體中的45個SNP位點進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)的分析，說明了不同種的遺傳結(jié)構(gòu)的不同主要是由于地理和時間差異造成的，這為資源保護(hù)、商業(yè)管理和自然漁業(yè)的發(fā)展提供一定的應(yīng)用基礎(chǔ)；CARVALHO小組[49]先后對鱈、舌鰨和大西洋鯡Clupea harengus三種經(jīng)濟(jì)魚種進(jìn)行了SNP分析，制造了一種SNP芯片，利用該芯片能夠有效確定漁獲物的來源地，可用于打擊非法捕撈。

3.5 分子遺傳育種中的應(yīng)用

目前隨著魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，需要對一些養(yǎng)殖物種進(jìn)行一定的遺傳性狀改良和良種的選育。傳統(tǒng)方法有耗時長和效果差等缺點，而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的分子育種技術(shù)可以在短時間內(nèi)對遺傳性狀進(jìn)行改良以及進(jìn)行良種選育。GOMEZ-RAYA等[50]認(rèn)為相對于傳統(tǒng)育種，分子輔助育種的使用可提高育種速度約11%。SNP標(biāo)記的發(fā)展能夠?qū)ξ锓N關(guān)聯(lián)性狀和相關(guān)遺傳特點進(jìn)行更準(zhǔn)確和快速地研究，有利于促進(jìn)養(yǎng)殖群體遺傳性狀改良與良種篩選的發(fā)展。在一項對北極嘉魚Salvelinus alpinus L.的基因與生長速率相互關(guān)系的研究中，TAO等[51]發(fā)現(xiàn)了1個與嘉魚早期生長有聯(lián)系的SNP位點。MC4R基因能夠產(chǎn)生一種黑皮素受體-4，是一種肽類物質(zhì)，對動物的能量代謝和質(zhì)量有著重要的的作用[52]；劉福平等[53]在羅非魚MC4R基因的研究中發(fā)現(xiàn)了5個SNP位點。由于這些位點在體質(zhì)量和體長方面具有一定的顯著性差異，因此猜測可以應(yīng)用于羅非魚的分子標(biāo)記輔助育種；張曉峰等[54]利用31個EST序列檢測69個與鯉魚Cyprinus carpio生長相關(guān)的SNP位點，促進(jìn)了關(guān)于鯉魚生長性狀的分子研究，可用于鯉魚的分子育種。MOEN等[55]通過對17 056個EST序列分析后，檢測出724個SNP位點，而且大多數(shù)的SNP位點顯示出很少的分化，他們認(rèn)為這些SNP分子標(biāo)記可以作為一種非常有力的工具應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

4 問題與展望

雖然SNP已經(jīng)有了一定長足的發(fā)展，但目前仍然存在著一些問題。首先，由于SNP屬于一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)，在人類等模式生物中已經(jīng)有了很多的應(yīng)用，但是在魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖當(dāng)中研究還比較少，沒有足夠的SNP位點信息用于相關(guān)的研究，因此發(fā)展較慢。另外使用SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析仍然存在很多障礙，疾病的突變率以及相關(guān)的分子標(biāo)記的突變率，分子標(biāo)記的適用性，等位基因的重組等因素都影響了SNP分子標(biāo)記的效果[56]，因此需要篩選更適宜的SNP標(biāo)記位點。還有現(xiàn)在很多公司都在紛紛進(jìn)行SNP的專利申請，加劇了研究者相互的競爭，不利于信息的交流。最后，目前的SNP標(biāo)記需要較大資金上的投入，設(shè)備儀器價格昂貴，對SNP標(biāo)記更多的研究局限于一些大型的實驗室。

總的來說，SNP的發(fā)展潮流很好。各種高效的SNP檢測技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)材料研制成功都會加速SNP的發(fā)展。近年來，SNP在相關(guān)魚類養(yǎng)殖的研究中已經(jīng)有了進(jìn)步，取得了良好的效果。通過SNP標(biāo)記技術(shù)可以對養(yǎng)殖群體資源進(jìn)行合理的評估、鑒定、保護(hù)和利用，最終將推動水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)的發(fā)展。

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