王丹丹 李燕華 張 競

卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，盡管其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中居第三位，但死亡率卻居第一位[1]。隨著宮頸癌、子宮內膜癌診斷和治療的不斷進展，卵巢癌已經(jīng)成為嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤之一，并且卵巢癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[2]。大部分卵巢癌患者確診時已至晚期,僅有25%的患者早期被發(fā)現(xiàn)[1]，晚期卵巢癌患者5年生存率較早期患者低，約從95%降至20%～30%[3]。因此，許多學者正致力于尋找比CA125更為有效，更為敏感的腫瘤標記物，應用于卵巢癌的早期診斷中。

人附睪蛋白4(HE4，又名WFDC2)基因的cDNA最早由Kichhoff等[4]首先從附睪的上皮遠端分離出來，是1種可能與精子成熟度有關的蛋白酶抑制劑。HE4基因位于染色體20q12～13.1上，全長為12 kb左右，由5個外顯子和4個內含子組成[5]，HE4的功能尚不確定。目前已有大量研究表明HE4在卵巢癌早期診斷中的價值明顯優(yōu)于CA125[6～11]。

目前，國內外關于HE4在卵巢癌中的相關研究大多集中于血清學方面，而有關組織中HE4表達情況的研究較少。本研究采用免疫組織化學技術，檢測正常卵巢組織、上皮性卵巢良性腫瘤組織及卵巢癌組織中HE4陽性表達及其與卵巢癌臨床分期、細胞分化及淋巴結轉移的關系。探討HE4在卵巢癌組織中的表達情況及其與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移的關系，從而為卵巢癌的診療及評估預后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本

標本來源于2008年1月～2010年7月蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科收治的87例患者；包括首次治療(術前未行放、化療)并行手術切除的卵巢癌患者47例，上皮性卵巢良性腫瘤20例(漿液性囊腺瘤14例、黏液性囊腺瘤6例)，同時選取20例正常卵巢組織作為對照。所選病例均有完整臨床資料及存檔蠟塊。隨訪截止日期為2011年11月，隨訪時間為7～46個月。

1.2 臨床資料

47例卵巢癌患者，年齡30～68歲，平均年齡52.25歲，≥52歲30例，<52歲17例；非卵巢癌患者年齡15～77歲，平均年齡39.29歲。根據(jù)UICC 2002版PTNM病理分期標準進行分期，早期(FIGOⅠ/Ⅱ期)卵巢癌28例，中、晚期(FIGO Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌19例；高分化20例，中、低分化27例；術后經(jīng)病理檢查證實淋巴結轉移者29例，無淋巴結轉移者18例。上皮性卵巢癌患者術前3個月內均未接受任何激素治療，未行化療或放療。復閱上述患者的病理切片，選取存檔標本石蠟塊進行切片，厚度4 μm。

1.3 試劑

鼠抗人HE4多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。S-P免疫組化試劑盒(通用型二步法試劑盒)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。試劑盒組成：試劑(無色液體)，3%去離子水過氧化氫溶液6 ml；試劑A(無色液體)，封閉用正常山羊血清工作液6 ml；試劑B(黃色液體)，生物素標記兔抗山羊IgG二抗工作液6 ml；試劑C(橙色液體)，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S -A/HRP)6 ml。DAB Kit(20 X ) (ZLI-9032)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。包括試劑A：濃縮緩沖液(20 X) 3 ml；試劑B：濃縮DAB溶液(20 X) 3 ml；試劑C：濃縮過氧化氫溶液(20 X) 3 ml。

1.4 主要儀器設備

切片機(德國Leitz產(chǎn)1512型)；攤片、烤片機(湖北孝感產(chǎn)CS-D型)；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市醫(yī)療器械廠產(chǎn)品)；微波爐(日本松下)；顯微鏡(日本Olympus)；顯微攝影顯微鏡(日本 Olympus)。

1.5 方法

1.5.1 載玻片處理 取玻片200張，置清潔液中浸泡14 h。取出玻片用自來水沖洗后，置60℃烤箱中烘干備用。

1.5.2 標本切片制備 標本均用術后10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。每例蠟塊連續(xù)切片3張，厚4～5 μm，二甲苯脫蠟，無水乙醇脫水，放入60℃烤箱中至少2 h以上。1張行HE染色，其余2張備染。

1.5.3 S-P法染色步驟 石蠟切片經(jīng)水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3 min×3次。每張切片加一滴過氧化物酶抑制劑，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育20 min?？乖迯停簩吮痉胖迷谛迯鸵?枸櫞酸鹽緩沖溶液pH 6.0，95℃，10 min)中，用微波爐高火加熱10 min，室溫下自來水冷卻10 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴非免疫性動物血清，室溫下孵育20 min，減少非特異性背景，不必沖洗，吸去多余血清。每張切片加1滴一抗，4℃冰箱中過夜。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴生物素標記的二抗，室溫下孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加1滴鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液。室溫下孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。去除PBS液，每張切片加2滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，陽性染色為棕黃色。顯色完成后，自來水沖洗，蘇木精復染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。實驗步驟嚴格按照說明書進行，陽性對照片由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，陰性對照片除用PBS代替一抗外，其余步驟相同。

1.6 判斷標準

實驗組和對照組均由我院病理科資深醫(yī)師，在相同條件下觀察每張切片并作出判斷。HE4免疫組化陽性染色為腫瘤細胞胞質內出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F塊。判斷方法：采用二次計分法，每例標本隨機計數(shù)5個高倍視野(×400)，計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞百分比并計分。首先按染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再按陽性細胞百分比計分，0分為陰性，陽性細胞數(shù)<10 %為1分，11 % ～ 50%為2分， 51% ～ 75 %為3分， >75 %為4分。上述兩項得分的乘積作為最終結果，積分≤ 2為陰性表達，>2為陽性表達。

1.7 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用χ2檢驗及相關分析的方法對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結果

2.1 正常卵巢、上皮性卵巢良性腫瘤及卵巢癌組織中HE4表達情況

HE4主要表達于卵巢上皮組織細胞胞質中，細胞核不著色，鏡下可見胞質中棕黃色顆粒均勻分布或粗細不等散在分布。正常卵巢組織中HE4蛋白表達陽性率為0(0/20)，上皮性卵巢良性腫瘤組織中其表達陽性率為10.0%(2/20)，卵巢癌組織中其表達陽性率為74.5%(35/47)。三組間兩兩比較顯示，卵巢癌組織其陽性表達率明顯高于正常卵巢組織和卵巢良性腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。正常卵巢組織與卵巢良性腫瘤組織HE4表達陽性率比較無明顯差別，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 3種組織中HE4表達情況(例)

注：△為與正常卵巢組織比較；※為與卵巢良性腫瘤組織比較；☆為與卵巢癌組織比較

2.2 HE4表達與卵巢癌臨床病理因素的關系

HE4表達陽性率中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌者顯著高于早期(Ⅰ/Ⅱ期)者(P<0.01)；中、低分化者其表達陽性率顯著高于高分化者(P<0.05)；淋巴結轉移者其表達陽性率也顯著高于無淋巴結轉移者(P<0.05)；HE4表達陽性率與卵巢癌患者年齡無關(P>0.05)，見表2。

表2 HE4表達與卵巢癌臨床病理因素的關系(例)

3 討論

3.1 HE4的生物學特性

HE4(human epididymis gene produet4)，人附睪蛋白4，其基因[5]位于染色體20q12～13.1上，全長為12 kb左右，由5個外顯子和4個內含子組成，并存在多種剪切方式，其編碼的小分子分泌型蛋白與細胞外蛋白酶抑制劑有很高的同源性，從蛋白結構上講是1種由乳清酸性蛋白(WAP-type fourdisulphide core protein,WFDC)基因編碼的相對分子質量是3 kD的分泌型糖蛋白，是蛋白酶抑制劑家族(具有保護性免疫作用)中的一員,該基因有多種剪切方式，可以編碼分泌小分子量的蛋白[12]。HE4 的生物學功能尚不清楚，它是否同家族中的蛋白酶抑制因子一樣具有蛋白水解酶抑制作用，還有待進一步研究證明。生物信息學分析結果提示：HE4基因的轉錄起始點位于翻譯起始密碼子ATG上游-28位C，HE4基因的啟動子中沒有經(jīng)典的TATA box和CCAAT box，該啟動子可能是1個TATA-less啟動子[13]。趙瑩珺等[14]利用轉染和熒光素酶報告基因等方法對人HE4 基因啟動子區(qū)開展了系統(tǒng)的分析，闡明了HE4基因的轉錄活性主要是由轉錄因子Sp1 與位于-71和-48的Egr-1位點結合所介導。在轉錄調控層面上進一步論證了HE4在卵巢癌組織中的高表達，有望被論證為1種高靈敏度和特異性的卵巢癌標志物，也為HE4在卵巢癌靶向性基因治療中提供了一定的理論依據(jù)，HE4基因有望成為控制腫瘤生長、轉移及治療腫瘤的新靶點，為卵巢癌的治療開辟了新途徑。

3.2 HE4在卵巢癌組織中的表達

目前，國內外關于HE4在卵巢癌中的相關研究大多集中于血清學方面，而關于組織中HE4表達情況的研究較少。目前報道[15～19]顯示HE4在93%漿液性卵巢癌和100%子宮內膜樣卵巢癌中呈高表達，在透明細胞癌組織中僅有50%的陽性表達率，黏液性腫瘤組織中未見表達，且在肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌等中亦未見表達，HE4 是目前診斷卵巢癌靈敏度最高的腫瘤標志物。Hellstrom等[20]比較了卵巢癌患者及正常人血清中 HE4 蛋白含量，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)卵巢癌患者血清中 HE4 蛋白表達明顯增高，提示該基因可能是1個卵巢癌相關基因。Drapkin等[15]還應用 RT-PCR技術研究發(fā)現(xiàn)，HE4 在卵巢惡性腫瘤細胞系中呈高表達，細胞培養(yǎng)液中含有分泌型 HE4，這與最近在血循環(huán)中發(fā)現(xiàn) HE4的報道相一致，這些結果提示，HE4 具有作為腫瘤標志物的前提條件。本研究結果顯示，HE4主要表達于卵巢癌組織上皮細胞的細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒或團塊。HE4在正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤組織中不表達或部分表達，在卵巢癌組織中其表達明顯升高(74.5%)，差異有統(tǒng)計學意義。結果提示HE4高表達與卵巢癌密切相關，大量表達的HE4可能通過某種機制，促進了卵巢上皮細胞的惡性轉化。

3.3 HE4表達與卵巢癌臨床病理因素的關系

有研究表明[21]HE4表達與卵巢癌臨床分期及淋巴結轉移均存在明顯相關性，HE4表達水平隨臨床分期進展、淋巴結轉移而升高。管桂峰等[22]在研究中發(fā)現(xiàn)HE4蛋白在卵巢癌組織中的表達與腫瘤分期呈正相關，即晚期卵巢癌患者血清HE4水平高于早期卵巢癌。Havrilesky等[23]研究結果也表明，HE4在卵巢癌不同期別中的敏感性不同，Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期中的敏感性分別為62.4%～82.7%和74.6%～92.5%。本研究結果顯示，早期(Ⅰ/Ⅱ期)卵巢癌組織中HE4表達陽性率(57.1%)明顯低于中、晚期(Ⅲ/Ⅳ期)卵巢癌組織(89.5%)。本研究還顯示卵巢癌高分化者HE4表達陽性率(65.0%)明顯低于中、低分化者(92.6%)，差異具有統(tǒng)計學意義。范玉平等[24]研究顯示，HE4 表達水平隨臨床分期的增高而增高，Ⅰ期與Ⅲ/Ⅳ期比較有顯著性差異，與本實驗研究結果相一致。可見HE4表達隨著卵巢癌的臨床分期、細胞分化的升高而升高。本研究結果亦顯示，在卵巢癌組織中有淋巴結轉移組HE4表達水平(72.4%)明顯高于無淋巴結轉移組(38.9%)，差異有統(tǒng)計學意義；郭冰沁等[25]研究得出：HE4陽性表達率隨著卵巢癌的病理分級增高而顯著增高，臨床分期愈晚表達率愈高，有腹腔器官及淋巴結轉移者明顯高于無轉移者，與本研究結果一致。Kamei等[26]應用免疫組化和RT-PCR技術，分析了120例接受了手術治療的乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)120例患者中71例患者均表達HE4 mRNA和HE4蛋白，HE4表達與臨床病理因素無相關性，但與淋巴結轉移密切相關。HE4表達陽性組5年無病生存率明顯低于HE4陰性組。數(shù)據(jù)表明，HE4表達與淋巴結轉移有關，可能是乳腺癌復發(fā)的一個預測指標。本實驗亦得出HE4與卵巢癌的淋巴結轉移密切相關。由此我們推測HE4可能通過某種機制參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移，由于目前國內外關于HE4作用機制的報道甚少，故具體機制目前還在進一步研究中。另外本研究還顯示HE4陽性表達與卵巢癌患者年齡(≤52歲和>52歲)無關，差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，HE4蛋白作為1種新型的腫瘤標志物正引起越來越多研究者的關注，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后方面的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，但是有關HE4蛋白的作用機制、作用細節(jié)及受調節(jié)的因素等研究甚少，還有很多功能仍未被發(fā)現(xiàn)，HE4與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移的關系尚需要進一步探討。

[1] 任海花,任衛(wèi)東,馬惠風.卵巢癌臨床流行病學調查報告〔J〕.基層醫(yī)學論壇,2009,13(2):62.

[2] Whitehouse C,Solomon E.Current status of the molecular characterization of the ovarian cancer antigen CA125 and implications for its use in clinical screening〔J〕.Gynecol Oncol,2003,88(1pt2):152.

[3] 樂 杰.婦產(chǎn)科學〔M〕.第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2004：305.

[4] Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymis specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors〔J〕,Biol Reprod,1999,45(2):350.

[5] Bingle L,Singleton V,Bingle CD,et al.The putative ovarian tumour marker gene HE4 (WFDC2),is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms〔J〕.Oncogene,2002,21(17):2768.

[6] Li J,Dowdy S,Tipton T,et al.HE4 as a biomarker for ovarian and endometrial cancer management〔J〕.Expert Rev Mol Diagn,2009,9(6):555.

[7] Moore RG,Brown AK,Miller MC,et al.The use of multiple novel tumor biomarkers for the detection of ovarian carcinoma in patients with a pelvic mass〔J〕.Gynecol Oneol,2008,108(2):402.

[8] Huhtinen K,Suvitie P,Hiissa J.Serum HE4 concentration differentiates malignant ovarian tumours from ovarian endometriotic cysts〔J〕.Br J Cancer，2009,100(8):1315.

[9] Abdel-Azeez HA,Labib HA,Sharaf SM,et al.HE4 and mesothelin:novel biomarkers of ovarian carcinoma in patients with pelvic masses〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2010,1(1):111.

[10] Hellstrom I,Hellstrom KE.SMRP and HE4 as biomarkers for ovarian carcinoma when used alone and in combination with CA125 and/or each other〔J〕.Adv Exp Bio1,2008,622(1):15.

[11] Kim YM,Whang DH,Park J,et al.Evaluation of the accuracy of serum human epididymis protein 4 in combination with CA125 for detecting ovarian cancer:a prospective case-control study in a Korean population〔J〕.Clin Chem Lab Med,2011,49(3):527.

[12] Bingle L,Singletonv Bingle CD.The putative ovarian tumour marker gene HE4 (wfdc2),is expressed in normal tissues and undergoes complex alternative splicing to yield multiple protein isoforms〔J〕.Oncogene,2002,21(17):2768.

[13] Smale S T.Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes〔M〕.Biochim Biophys Acta,1997:1351.

[14] 趙瑩珺,楊劍峰,朱景德.人卵巢癌相關候選基因 HE4(WFDC2)的轉錄調控主要由 Sp1與位于-71 和-48 的 Egr-1 位點結合所介導〔J〕.腫瘤,2004,24(6):517.

[15] Drapkin R,von Horsten HH,Lin Y,et al.Human epididymis protein 4 (HE4) is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas〔J〕.Cancer Res,2005,65(6):2162.

[16] Duffy MJ,Shering S,Sheery F,et al.CA153:a prognostic marker in breast cancer〔J〕.Int J Biol Markers,2000,15(4):330.

[17] 黃 琛,詹喜炎,湯漢紅.血清基質蛋白酶-9、CA15-3、癌胚抗原聯(lián)合檢測在乳腺癌診斷中的價值〔J〕.國際檢驗醫(yī)學雜志,2008,29(7):635.

[18] Einarsson R,Lindman H,Bergh J.Use of TPS and CA15-3 assays for monitoring ehemotherapy in metastatic breast cancer patients〔J〕.Antieaneer Res,2000,20(6D):5089.

[19] 陳建偉,宋建國.CA15-3,CEA及CA125聯(lián)合檢測對乳腺癌診斷的意義〔J〕.上海醫(yī)學檢驗雜志,2000,15(4):256.

[20] Hellstrom I,Raycraft J,Hayden-LedbetterM,et al.The HE4(WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma〔J〕.Cancer Res,2003,63(13):3695.

[21] Guan GF.Expression and clinical significance of OPN and HE4 gene protein in epithelial ovarian cancer〔J〕.Journal of Medical Forum,2009,30(10):9.

[22] 管桂峰.OPN及HE4基因在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義〔J〕.Journal of Medical Forum,2009,6(30):9.

[23] Havrilesky LJ,Whitehead CM,Rubatt JM,et al.Evaluation of biomarker panels for early stage ovarian cancer detection and monitoring for disease recurrence〔J〕.Gynecol Oncol,2008,110(3):374.

[24] 范玉平,陶國華.聯(lián)合檢測 HE4 和 CA125 對卵巢癌早期評估的價值〔J〕.標記免疫分析與臨床,2010,17(6):368.

[25] 郭冰沁,俞 嵐.HE4、NF-κBp65和MMP-9在卵巢上皮性腫瘤中的表達及其臨床意義〔J〕.中國組織化學與細胞化學,2011,12(6):578.

[26] Kamei M,Yamashita S,Tokuishi K,et al.HE4 expression can be associated with lymph node metastases and disease-free survival in breast cancer〔J〕.Anticancer Res,2010,30(11):4779.