李俊華 袁向亮 沈立松

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，也是致死率最高的惡性腫瘤之一。關于胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制目前仍不明確。GSN是胞質內重要的actin調節(jié)蛋白。GSN廣泛表達于正常組織中[1]，在機體生命活動中發(fā)揮重要作用，已有研究顯示，GSN具有明顯地腫瘤抑制作用，在多種腫瘤中其表達水平明顯降低，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，被認為是1種候選的抑癌基因[2]。本研究應用免疫組化蛋白印跡法，檢測GSN在胃癌組織及其癌旁組織中的表達情況，并探討其表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關系及其意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2008年1月至2010年12月本院收治的、28例胃癌患者手術切除的胃癌組織標本。男性17例，女性11例，平均年齡64.6歲。組織學分級：高分化10例，中分化8例，低分化和未分化10例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期7例。另收集2011年1月至2012年1月本院手術切除的新鮮胃癌組織及相應的癌旁組織各12例，其中男性6例，女性6例，平均年齡60歲?；颊咝g前未行放、化療及免疫治療。

1.2 試劑和儀器

鼠抗人GSN單克隆抗體(美國Sigma公司)；封閉液(Horse serum)；二抗(anti-mouse IgG)和ABC液均采用VECTASTAIN ABC KIT(美國Vector Laboratories公司)中的試劑。組織蛋白提取液為T-PER Tissue protien Extraction Reagent(美國Thermo公司)；二抗為Goat anti-Mouse IRDY 800CW(美國LI-COR Biosciences公司)；Odyssey掃膜儀(美國LI-COR Biosciences公司)。

1.3 免疫組化

常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，免疫組化ABC法染色。常規(guī)脫蠟脫水后用檸檬酸鈉(pH 6.0)作為抗原修復液，120℃高壓修復3 min，3%過氧化氫滅活內源性過氧化酶，封閉30 min，一抗4℃過夜，一抗為鼠抗人GSN單克隆抗體，工作濃度為1∶1000，用PBS取代一抗作為陰性對照，以已知陽性切片作為陽性對照。二抗、封閉液和ABC液均采用VECTASTAIN ABC KIT中的試劑。DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。

1.4 蛋白印跡

新鮮組織手術切除后半小時內放置液氮內速凍，然后于-80℃保存，標本收齊后集中提取蛋白。200 mg組織中加入1000 μl蛋白提取液和10 μl蛋白酶抑制劑，剪碎后勻漿，高速離心后取上清加上樣緩沖液煮沸冷卻后上樣電泳。常規(guī)電泳，用PDVF膜轉膜，Odyssey封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜，一抗為鼠抗人GSN單克隆抗體，工作濃度為1∶1000；二抗為羊抗鼠熒光二抗，工作濃度為1∶5000，二抗室溫孵育1 h，洗膜后，用Odyssey掃膜儀掃膜。

1.5 免疫組化結果判定及分級標準

免疫組化結果采用雙盲法。以已知陽性片作為陽性對照，每組均用PBS代替一抗作為陰性對照。根據陽性細胞百分比及染色強度進行綜合評分，陽性細胞百分比為5個高倍鏡(10 × 40)隨機視野下陽性細胞百分比。按染色強度評分：無色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞百分比評分：0分為無陽性細胞，陽性細胞百分比≤10%為1分， 11%～50%為2分， 51%～80%為3分，﹥80%為4分。最后按以上兩項評分的乘積進行綜合評分。每張切片由兩名高年資病理科醫(yī)生分別計數評分。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 GSN在胃癌組織中的表達情況

GSN表達水平在正常胃腺上皮細胞、部分異形性增生胃腺上皮細胞及胃癌腫瘤細胞中，呈逐漸下降趨勢。GSN在正常胃腺上皮細胞中呈高表達，胞質呈棕黃色，胞核染成棕褐色；在胃癌腫瘤細胞中GSN普遍呈低表達，胞質染成淡黃色，胞核基本未著色。部分異形性增生腺上皮細胞，胞質染成淡黃色，胞核染成棕黃色，部分細胞胞核未著色。

2.2 不同臨床分期胃癌組織中GSN表達情況

Ⅰ期胃癌組織中可見部分腫瘤細胞胞質和胞核均被染成棕黃色，陽性細胞百分率為34.7%，GSN表達得分為2.75±0.91。Ⅱ期胃癌組織中GSN表達明顯減弱，部分腫瘤細胞胞質染成淺黃色，大多數腫瘤細胞胞核無明顯染色，GSN陽性細胞百分率為26.3%，GSN表達得分為2.23±0.95。Ⅲ期胃癌組織中只有少數腫瘤細胞出現(xiàn)陽性染色，陽性細胞百分率為5.3%，GSN表達得分為1.07±1.10。Ⅳ期胃癌組織中GSN幾乎無表達，陽性細胞百分率僅為2.2%，GSN得分為0.74±0.61。可見，GSN表達隨著胃癌臨床分期的增加而逐漸減弱，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 GSN在TNM不同分期胃癌中的表達情況

2.3 GSN表達與胃癌臨床病理特征的關系(表1)

GSN表達與胃癌患者年齡、性別無關(P>0.05)，與腫瘤細胞的分化程度、浸潤程度和淋巴結有無轉移有一定相關性，其中中低分化胃癌組織GSN表達水平明顯低于高分化胃癌患者，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2a)。腫瘤浸潤至漿膜層及其以外的病例GSN表達水平明顯低于腫瘤局限于漿膜層內的病例，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2b)。淋巴結轉移者GSN的表達強度明顯弱于無淋巴結轉移者，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2c)。

表1 GSN表達與胃癌臨床病理特征的關系

圖2 GSN表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.4 GSN在胃癌組織及癌旁組織中的表達情況

由圖3可見，胃癌組織中GSN表達水平明顯低于相應的癌旁組織；本組12例胃癌組織中10例患者GSN表達量明顯低于相應的癌旁組織，GSN低表達率為83.3%(10/12)。

圖3 GSN在胃癌組織及相應癌旁組織中的表達情況

3 討論

GSN是胞質內重要的actin調節(jié)蛋白，可調節(jié)肌動蛋白的重組，參與多種與細胞骨架排列相關的細胞進程。更多研究表明，GSN在細胞信號傳導中作為轉錄輔助因子對細胞周期、凋亡起調控作用[3]。GSN與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，被認為是1種候選的抑癌基因[2]。本研究發(fā)現(xiàn)GSN在胃癌細胞及腫瘤組織中的表達明顯降低，并隨著腫瘤進展及分化程度降低而降低，GSN在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能起著抑制作用。

許多研究發(fā)現(xiàn)GSN在多種腫瘤中表達明顯降低。在人膀胱癌中，GSN在6個膀胱癌細胞系和77.8%(14/18)的膀胱癌組織中表達缺失和明顯降低[4]。在乳腺癌中，GSN的蛋白和mRNA的表達水平在乳腺癌細胞系中缺失或明顯低于正常人乳腺上皮細胞和良性永生化細胞。免疫組織化學顯示，GSN在70%的浸潤性乳腺癌[5]、55%(48/68)的非小細胞肺癌[6]、68.1%(15/22)的胃癌[7]和62.7%(32/51)的口腔鱗癌組織[8]中表達明顯降低。本實驗中，采用免疫組化方法，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌腫瘤組織切片中GSN在腫瘤細胞中的表達也明顯低于正常腺上皮細胞。我們還通過蛋白印跡法檢測到在新鮮的胃癌組織中GSN的表達明顯低于與之對應的癌旁組織。但是GSN在腫瘤細胞中低表達的機制目前并不是很清楚。有研究表明，在人乳腺癌和非小細胞肺癌中，調控GSN的基因序列并沒有發(fā)生突變、重組和缺失[5,6]。有關胃癌的研究中，研究者認為，在胃癌組織中組蛋白去乙?；?的高表達與GSN的低表達密切相關，而組蛋白乙酰-去乙酰之間的轉換對調控細胞周期、凋亡、分化有重要作用[7]。說明GSN在腫瘤中的低表達是由于基因外的機制調控的。另外有關胰腺癌的研究表明，泛素-蛋白酶體途徑參與了GSN的降解，使得GSN在胰腺癌中呈低表達[9]。說明蛋白翻譯后修飾也是GSN在腫瘤中低表達的一個重要因素。

有學者對GSN在腫瘤中表達明顯降低的現(xiàn)象進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)將外源GSN cDNA全長轉入膀胱癌細胞系過表達后，可抑制腫瘤細胞生長，降低腫瘤細胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性。重組腺病毒編碼的野生型GSN(Ad-GSN)轉入膀胱癌細胞系后可以使細胞停滯于G/M期，原位膀胱癌動物模型經Ad-GSN治療后，腫瘤體積縮小了90%[10]，這些實驗證據提示GSN具有明顯地腫瘤抑制作用。許多研究證實，GSN低表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及不良預后等有關。有研究表明，GSN低表達與卵巢癌分化程度密切相關，在分化程度較高的腫瘤細胞中GSN表達水平明顯高于未分化的腫瘤細胞[11]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，GSN表達與胃癌TNM分期、分化程度、淋巴結轉移和浸潤程度有關。晚期胃癌中GSN表達強度明顯低于早期胃癌。中低分化和未分化的腫瘤細胞中GSN的表達水平明顯低于高分化腫瘤細胞。腫瘤浸潤到漿膜層及漿膜層之外的胃癌患者GSN表達水平明顯低于局限于漿膜層之內的患者。說明GSN在胃癌腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展中起著一定的調控作用，隨著腫瘤的發(fā)展，GSN表達明顯下降，失去了調控細胞周期、調節(jié)細胞凋亡的作用，使得腫瘤細胞生長失控，從而促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與之相反的是在膀胱移形細胞癌中，隨著腫瘤分級和分期的增加，GSN表達逐漸增強，并且在腫瘤后期GSN表達的逐漸增強與腫瘤預后密切相關，研究者認為這與GSN可以增強細胞運動有關，進而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]。而在本實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結轉移的病例中GSN表達水平明顯低與無淋巴結轉移的病例，表明GSN在腫瘤轉移中可能起抑制作用，GSN表達的降低失去了對actin微絲細胞骨架的調控作用，使細胞的運動性、形狀、生長以及凋亡發(fā)生了改變。這與Tanaka等[13]的研究一致，通過小RNA干擾乳房上皮細胞中GSN的表達后，乳房上皮細胞發(fā)生了明顯的變化，成纖維細胞發(fā)生了類型轉化，接觸抑制現(xiàn)象消失，細胞成單層灶狀生長，侵襲性和運動能力增強[11]，說明對腫瘤的侵襲和轉移GSN起著抑制作用。

綜上，本實驗證實了GSN在胃癌組織中表達缺失或明顯降低，并且GSN表達與腫瘤分化、浸潤及淋巴結轉移密切相關，這可能是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。GSN作為一個候選的抑癌癌基因，在多種腫瘤中普遍呈低表達，可是GSN低表達的機制和其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用并不是很明確。另外GSN還是1種分泌型蛋白存在于血清中，因此檢測血清中GSN的表達水平可能成為一個有價值的腫瘤診斷標志物[14]。GSN在胃癌中表達情況的研究國內暫無相關報道，國外的相關報道也較少，我們的研究或許對胃癌機制的研究提供了新的思路。

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