李玉莉，陳曉峰，韓 雪，苗國厚，胡 慶，雷 波(1.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640)

(2.國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)(3.廣東省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

微納米生物玻璃的體外成骨性能研究

李玉莉1，2，3，陳曉峰1，2，3，韓 雪1，2，3，苗國厚1，2，3，胡 慶1，2，3，雷 波1，2，3(1.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640)

(2.國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006)(3.廣東省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

微納米生物活性玻璃因其具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化性能目前引起眾多研究者的關(guān)注，但是目前對(duì)微納米生物活性玻璃的結(jié)構(gòu)及形態(tài)對(duì)細(xì)胞性能的影響研究的較少。本文通過溶膠－凝膠法結(jié)合模板仿生技術(shù)合成了具有特殊結(jié)構(gòu)和形態(tài)的微納米生物活性玻璃，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究了這種微納米結(jié)構(gòu)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨性能(ALP，Runx2，Col1a1和OPN)的影響，結(jié)果證明具有規(guī)則形態(tài)的生物活性玻璃(SBG)相比不規(guī)則形態(tài)的生物活性玻璃(IBG)更能促進(jìn)細(xì)胞的體外成骨性能，為將來設(shè)計(jì)具有特定結(jié)構(gòu)的生物活性玻璃提供了參考依據(jù)。

微納米生物玻璃;溶膠－凝膠技術(shù);堿性磷酸酶;成骨基因

1 前言

由美國佛羅里達(dá)大學(xué)Larry L.Hench教授于20世紀(jì)70年代初研制的生物活性玻璃(Bio-Active Glass)是無機(jī)類生物活性材料的一個(gè)重要組成部分［1］。其與之前的生物材料的最大的區(qū)別，是可以與骨組織形成鍵合。由于其具有良好的生物活性，能夠與骨形成牢固的化學(xué)結(jié)合，一問世便引起國際生物材料學(xué)界的高度關(guān)注。經(jīng)過10多年的研究，在1985獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床［2］，并引發(fā)了生物活性玻璃研究的熱潮。目前，對(duì)生物玻璃的結(jié)構(gòu)、理化及生物學(xué)性能研究仍在不斷深入，特別是近年來，在生物玻璃的細(xì)胞學(xué)研究方面取得一些突破性進(jìn)展，證明生物玻璃具有一定的細(xì)胞和基因激活作用，這對(duì)于骨組織的再生修復(fù)是一個(gè)關(guān)鍵因素［3－5］。溶膠 －凝膠法是一種新興的技術(shù)，在20世紀(jì)90年代才被引用到生物玻璃的制備過程中來［6］。由于溶膠－凝膠技術(shù)室溫可控，后續(xù)的熱處理溫度在600～700℃，在工藝上易于操作。并且，制備的生物玻璃具有多孔結(jié)構(gòu)、密度小、比表面積高，生物活性高，在保持生物活性的前提下，其化學(xué)組成可在較大范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，是一種非常有前途的制備方法。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著納米時(shí)代的到來，為了進(jìn)一步改善生物活性材料的組織修復(fù)特性，近年來對(duì)生物活性材料的納米化，引起國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)材料學(xué)界的廣泛重視。但由于微納米生物玻璃與傳統(tǒng)的生物玻璃45S5和溶膠－凝膠生物玻璃58S、77S和70S30C等，在形態(tài)上存在很大的區(qū)別，因此，單純從生物玻璃溶出離子角度很難評(píng)價(jià)微納米生物活性玻璃的形態(tài)對(duì)細(xì)胞學(xué)行為的影響。

本文采用溶膠－凝膠技術(shù)結(jié)合有機(jī)模板法，制備了一種具有規(guī)則形態(tài)的微納米生物活性玻璃，并通過體外實(shí)驗(yàn)研究了這種形態(tài)的生物活性玻璃對(duì)細(xì)胞行為的影響，考察了其對(duì)成骨基因表達(dá)的影響。

2 材料與方法

2.1 生物玻璃的制備與表征

以生物活性良好的化學(xué)組分為60%SiO2，36%CaO，4%P2O5(摩爾百分?jǐn)?shù))的溶膠－凝膠生物玻璃(58S)為研究對(duì)象。制備微球顆粒形態(tài)的60S生物玻璃工藝過程主要分為以下幾步:將一定量的檸檬酸(CA)溶解于無水乙醇的水溶液中，磁力攪拌10 min，形成溶液A;將一定量的前驅(qū)體原料正硅酸乙脂(TEOS)、磷酸三乙脂(TEP)、四水硝酸鈣按順序加至溶液A中，形成溶膠B;將一定量的聚乙二醇(PEG-6000，PEG-10000)加入到溶膠B中并繼續(xù)攪拌 4 h，以使生物玻璃的前驅(qū)體充分水解以及PEG分子的成形組裝;將充分水解的溶膠B裝入密封的50 ml塑料離心管中，于60℃水熱老化24 h;將塑料管中的濕凝膠取出于60℃干燥24 h;將烘干好的干凝膠研磨后，置入高溫爐中以10℃/min升至600℃熱處理2 h，研磨無需過篩即可得到分散良好的生物活性玻璃微球顆粒。

樣品的微納米結(jié)構(gòu)形貌采用日本JSM6330F高分辨場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSCs)取自非造血系統(tǒng)、非遺傳性疾病且未累及骨髓的正常成人骨髓，將原代細(xì)胞置于低糖培養(yǎng)基(L-DMEM，GIBCO)中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁并匯合成單層后，按1∶3傳代進(jìn)行擴(kuò)增。傳至第3代，消化離心以 1×105個(gè)/cm2密度，分別在成骨誘導(dǎo)液、L-DMEM中，將兩種生物玻璃與細(xì)胞共培養(yǎng)，考察其成骨性能。

2.3 檢測項(xiàng)目與方法

2.3.1 堿性磷酸梅(ALP)活性檢測

蛋白提取細(xì)胞和生物玻璃在6孔板中培養(yǎng)6，10 d時(shí)，用冰冷的PBS洗兩次，加入300 μl ALP裂解液，轉(zhuǎn)移到EP管中，冰上裂解數(shù)分鐘。用超聲細(xì)胞破碎機(jī)超聲裂解。然后轉(zhuǎn)移到冰凍離心機(jī)中，13 000 rpm離心2 min，將上清液分裝，－80℃冰凍保存。

堿性磷酸酶(ALP)測定將200 μl濃度5 mmol/L的對(duì)硝基苯酚(p-Nitrophenol，BIO BASIC INC)加入到1.5 ml的EP管中，再將解凍的樣品吸取20 μl加入，37℃水浴15 min。再加入0.5 ml濃度0.1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取410 nm處的讀數(shù)。

BCA測定總蛋白按照BCA試劑盒(BCATM Protein Assay Kit，Thermo)的說明，吸取每一份待測液25 μl注入96孔板中，加200 μl的BCA工作液到每一個(gè)孔中，在搖床上搖晃30 s使液體充分的混勻，再蓋上孔板37℃孵化30 min。結(jié)束后將孔板取出，冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測量562 nm處的吸光度。

堿性磷酸酶(ALP)活性等于ALP測定的觀測值與總蛋白測定的觀測值之比。

2.3.2 成骨基因檢測

RNA的提取將與材料復(fù)合培養(yǎng)5 d的細(xì)胞抽提RNA。每孔加入 1 ml Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)反復(fù)吹打，按照說明書上的步驟抽提RNA，將干燥后的 RNA溶于20 μl的 DEPC水中，在 NanoDrop2000(Thermo Scientific)上檢測RNA濃度，并立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

RNA的逆轉(zhuǎn)錄取500 ng總RAN，采用Fermentas Life Sciences公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，在PCR儀(TC-412，TECHNE公司)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄完成后，cDNA立即進(jìn)行Real-time PCR(qRT-PCR)。

Real-time PCR(qRT-PCR)檢測采用TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq在實(shí)時(shí)定量 PCR儀(Chromo4，BIO-RAD公司)上進(jìn)行 Real-time PCR(qRT-PCR)檢測，引物序列見表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of correlative genes for osteogen

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Version 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中組間比較采用One-Way ANOVA法分析，方差齊時(shí)采用S-N-K法分析統(tǒng)計(jì)顯著性水平為P＜0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 生物活性玻璃微球制備技術(shù)對(duì)微球形貌的影響

實(shí)驗(yàn)前期研究了酸催化溶膠－凝膠技術(shù)結(jié)合PEG作模板劑制備微納米生物活性玻璃的過程中，PEG分子量對(duì)微納米生物活性玻璃的形貌和尺寸的影響［7］。研究發(fā)現(xiàn)，PEG6000制備得到直徑為5 μm左右的規(guī)則的微米球，球體表面有明顯的微納米裂紋(SBG，圖1a，b);當(dāng)使用PEG10000制備時(shí)，合成了不規(guī)則的納米生物活性玻璃顆粒，尺寸在70～200 nm之間，顆粒之間有輕微團(tuán)聚(IBG，圖1c，d)。

圖1 生物活性玻璃微球的SEM照片:(a，b)SBG，(c，d)IBGFig.1 SEM micrographs of bioactive glasses:(a，b)SBG and(c，d)IBG

3.2 SBS和IBS生物活性玻璃微球?qū)MSCs成骨性能影響的比較

堿性磷酸酶(ALP)在成骨誘導(dǎo)初期由成骨細(xì)胞分泌，是骨前體細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志之一［8］，常用堿性磷酸酶活性來定量表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的水平。從圖2可以看出，6 d和10 d時(shí)成骨誘導(dǎo)下SBG和IBG的ALP的表達(dá)水平比對(duì)照組都要高，且具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，成骨誘導(dǎo)環(huán)境中SBG的ALP表達(dá)均值在6 d和10 d時(shí)比IBG組要高，但是不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在非成骨誘導(dǎo)環(huán)境下，SBG在10 d時(shí)ALP表達(dá)水平比IBG高。因此，SBG顯示出比IBG更好的ALP表達(dá)的情況。

3.3 成骨基因表達(dá)

Ι型膠原(COL1a1)由骨細(xì)胞生產(chǎn)的骨基質(zhì)中的主要有機(jī)成分［9－12］; 骨橋蛋白(OPN)是骨細(xì)胞通過它們的αVβ3 整合素錨釘?shù)降V化的骨表面［9－10，13］; 成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)是骨生成的“主導(dǎo)基因”，敲除Runx2的老鼠不能成骨(只形成軟骨的骨架，但是缺乏礦化的組織)［9，14－15］。

實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)的方法，測定相關(guān)成骨基因表達(dá)，同樣通過持家基因GAPDH對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行均一化，圖3是誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，HMSCs在4種生物活性玻璃上相關(guān)成骨基因表達(dá)的情況。HMSCs分別在成骨誘導(dǎo)液和普通完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)條件下，Runx2、OPN和COL1a1這3個(gè)與成骨相關(guān)的基因的表達(dá)量，成骨誘導(dǎo)組要明顯高于對(duì)照組的。兩種生物玻璃的成骨誘導(dǎo)組和成骨對(duì)照組，Runx2這個(gè)促使積極分裂的成骨前體細(xì)胞轉(zhuǎn)向分化的相關(guān)基因已經(jīng)高表達(dá)，而且成骨誘導(dǎo)組高于對(duì)照組，表明兩種生物玻璃在外環(huán)境下培養(yǎng)5 d，HMSCs在兩種培養(yǎng)條件下，特別是在成骨誘導(dǎo)的條件下，生物玻璃上的細(xì)胞已經(jīng)從G1期走向G0期，退出了細(xì)胞周期，從有絲分裂轉(zhuǎn)向細(xì)胞分化，并通過激活骨細(xì)胞表型基因，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成熟。其中在成骨誘導(dǎo)環(huán)境下，SBG組明顯高于IBG組。

圖2 HMSCs在兩種生物玻璃微球誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d和10 d后ALP表達(dá)的情況Fig.2 Alkaline phosphatase(ALP)activity of HMSCS seeded for 6 d and 10 d

從圖3可以看出，誘導(dǎo)組的OPN和COL1a1與骨細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)的基因表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)，并且明顯可見，誘導(dǎo)組的上調(diào)量高于對(duì)照組的。其中，在誘導(dǎo)環(huán)境下SBG組的基因表達(dá)量又明顯高于IBG，尤其是OPN表達(dá)差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。從基因的相對(duì)表達(dá)量可見，與I型膠原合成相關(guān)的COL1a1基因作為細(xì)胞分化早期的標(biāo)志物，其相對(duì)于其他基因有較高的表達(dá)量，標(biāo)志著I型膠原這種骨組織的主要細(xì)胞外基質(zhì)逐步走向成熟。此外，其大量的合成和分泌還會(huì)為組織的礦化、鈣結(jié)節(jié)的形成提供基底，并對(duì)成骨細(xì)胞表型的分化起到加速的作用?？梢姡琒BG在成骨誘導(dǎo)的條件下，已經(jīng)相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，更早的進(jìn)入了這種時(shí)期。

圖3 HMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d后，成骨基因的表達(dá)Fig.3 Gene expression levels of osteogenic markers for cells seeded on SBG as measured at 5 d culture

基于近幾年的研究，Hench教授于2009年對(duì)生物玻璃的基因激活作用的機(jī)理提出了一個(gè)假說:從生物玻璃中溶出的離子，激活了細(xì)胞的基因朝著再生和自我修復(fù)的方向發(fā)展。生物玻璃中可溶性含水Si及Ca離子基團(tuán)，溶出所形成的局部化學(xué)微環(huán)境，有利于激發(fā)內(nèi)皮祖細(xì)胞的成骨細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的活性階段(從G1期進(jìn)入S期)［16］。因?yàn)镠ench教授的理論主要是針對(duì)45S5提出的，所以更多的是注重溶出離子而沒有將生物玻璃的其他性能考慮在內(nèi)。Jell等［17］提出了另外一個(gè)更加全面的機(jī)制，同時(shí)考慮到生物玻璃溶出離子、表面化學(xué)以及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)幾方面的影響，更加適合新型生物玻璃(圖4)。細(xì)胞不斷地通過自己的受體檢測其周圍環(huán)境中的細(xì)胞因子、趨化因子、機(jī)械應(yīng)力、氣體和重要的生理離子等，細(xì)胞表面受體(如整合素)與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子細(xì)胞級(jí)聯(lián)，最終通過級(jí)聯(lián)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子Runx2)，啟動(dòng)或關(guān)閉基因的表達(dá)，生物活性玻璃激活的基因(以前報(bào)告的是由生物玻璃45S5上調(diào)或下調(diào)基因)DNA解螺旋，轉(zhuǎn)錄成mRNA和翻譯成蛋白質(zhì)(圖4)，這些蛋白質(zhì)決定了細(xì)胞表型，因此回應(yīng)了最初的激活作用，也就是增殖、分化、基質(zhì)形成或細(xì)胞死亡的初始刺激的反應(yīng)。

圖4 生物活性玻璃基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制示意圖Fig.4 Gene expression regulation mechanisms by bioactive glasses

4 結(jié)論

生物玻璃可以通過形態(tài)來影響成骨基因的表達(dá)。具有規(guī)則球形的生物玻璃相比具有不規(guī)則納米結(jié)構(gòu)的生物玻璃，更能促進(jìn)ALP的表達(dá)及成骨相關(guān)基因COL1a1、OPN和Runx2的表達(dá)，為我們將來設(shè)計(jì)生物玻璃的形態(tài)，提供了理論依據(jù)。

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Biocompatibility and Osteogenesis of Micro-and Nano-Bioactive Glasses

LI Yuli1，2，3，CHEN Xiaofeng1，2，3，HAN Xue1，2，3，MIAO Guohou1，2，3，HU Qing1，2，3，LEI Bo1，2，3
(1.School of Materials Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China)(2.National Engineering Research Center for Tissue Restoration and Reconstruction，Guangzhou 510006，China)(3.Guangdong Province Key Laboratory of Biomedical Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China)

Because of the special morphology and characterization，micro-and nano-bioactive glass caused much attention by researchers，but the morphology of micro-and nano-bioactive glass on cell performance has been underappreciated and underinvestigated.The special morphology of micro-and nano-bioactive glass was synthesized by the Sol-gel method combined with the template bionic.Human mesenchymal stem cells(hMSCs)were seeded on bioactive glass for 6 days and 10 days in vitro for alkalic phosphatase(ALP)activity and 5days for osteogenic gene expression analysis.Based on the results of ALP activity and osteogenic gene expression analysis，the responses of hMSCs to the SBG exhibited a higher degree of osteogenic differentiation than those on IBG in vitro.This work will provide a reference for design of specific morphology of the bioactive glass in the future.

micro-and nano-bioactive glass;Sol-gel method;alkaline phosphatase;osteogenic gene expression

R318.08

A

1674－3962(2012)06－0007－05

2012－04－11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50830101，51072055，51172073);華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目，(2012ZP0001)

李玉莉，女，1979年生，博士

陳曉峰，男，1956年生，教授，博士生導(dǎo)師