張 玉，王 偉，徐麗紅，王建清

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

堿性嫩黃O、酸性橙II、堿性橙II、羅丹明B、對(duì)位紅均為偶氮類工業(yè)染料。廣泛用于紡織、皮革、造紙、橡膠、塑料、涂料、化妝品、木材加工等，它們具有一定的毒性，部分還有致癌性，因此禁止作為食品添加劑使用。但由于工業(yè)染料色澤鮮艷、著色穩(wěn)定且價(jià)格低廉，一些不法商販將其用于食品生產(chǎn)與加工，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的身體健康［1-2］。

目前對(duì)于食品中違禁色素的檢測(cè)方法已有一定研究，主要有薄層色譜法、液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［3-9］。但大多數(shù)研究集中在對(duì)1～2種物質(zhì)的檢測(cè)。為此，我們通過(guò)固相萃取技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法，建立食品中堿性嫩黃O、酸性橙II、堿性橙 II、羅丹明 B、對(duì)位紅同步測(cè)定方法。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品、試劑與儀器

檢測(cè)樣品有辣椒醬和腐竹。

試劑有標(biāo)準(zhǔn)品堿性嫩黃O(純度95%)、酸性橙II(純度98%)、堿性橙 II(純度98%)、羅丹明B(純度92%)、對(duì)位紅 (純度96%);甲醇和乙腈 (色譜純);乙醇 (分析純)。

儀器有戴安Ultimate-3000高效液相色譜儀，帶紫外檢測(cè)器;超聲波清洗器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;離心機(jī);HLB固相萃取小柱 (200 mg，3 mL)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取堿性嫩黃 O、酸性橙 II、堿性橙 II、羅丹明B、對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g，分別置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為1.0 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

分別吸取5.0 mL 5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，混勻后，用甲醇定容至刻度，得到濃度為50 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再移取50 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，1.0，2.0，分別置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，此標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0 mg·L-1。

1.3 樣品前處理

稱取5.0 g搗碎樣品置于50 mL離心管中，加入30 mL乙醇和乙腈混合液 (V/V為80∶20)，高速均質(zhì)1 min，超聲萃取20 min，離心，移出上清液，殘?jiān)?0 mL乙醇和乙腈混合液再提取1次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干后，加入2 mL乙醇和乙腈混合液溶解，再加入8 mL水混勻?yàn)榇齼艋骸?/p>

依次用5 mL甲醇和5 mL水活化固相萃取柱，將待凈化液全部上柱。依次用10 mL甲醇和10 mL正己烷洗脫，接收并合并洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干后，加2 mL乙醇和乙腈混合液溶解，然后定容。

1.4 色譜分析條件

流動(dòng)相:甲醇、乙酸銨緩沖液和乙腈梯度洗脫(表1)，色譜柱:C18，4.6 mm×250 mm(5μm);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣體積:20μL;波長(zhǎng)450 nm，480 nm，530 nm。

表1 色譜柱洗脫的流動(dòng)相梯度

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

對(duì)5種色素的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)5種色素的最大吸收波長(zhǎng)分別為:堿性嫩黃 O，435 nm;酸性橙II，480 nm;堿性橙II，430 nm;羅丹明B，530 nm;對(duì)位紅，480 nm。

綜合考慮幾種色素的最大吸收波長(zhǎng)，進(jìn)行分段波長(zhǎng)檢測(cè)，即0～15 min檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，15～20 min檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm，20～27 min檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm。

2.2 液相色譜條件的確定

根據(jù)樣品分離情況，優(yōu)化流動(dòng)相流速及配比，確定用甲醇、乙酸銨緩沖液和乙腈梯度洗脫。從圖1-2看出，樣品中堿性嫩黃O、酸性橙II、堿性橙II、羅丹明 B、對(duì)位紅能夠完全分離，得到理想色譜。

圖1 5種工業(yè)染料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜

2.3 提取液的選擇

圖2 腐竹樣品添標(biāo)色譜

采用不同的提取液對(duì)樣品中的色素進(jìn)行提取，結(jié)果 (表2)4種提取液對(duì)樣品中色素的提取回收率80.2%～101.2%，其中乙醇+乙腈混合液提取后，不同色素回收率為85.1%～98.8%，差異較小，因此確定此混合溶劑作為提取液。

表2 不同提取液提取5種色素的回收率

2.4 固相萃取條件篩選

由于樣品提取液中含有一定的雜質(zhì)，會(huì)干擾色素的色譜分離，因此采用固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。先采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行固相萃取條件篩選。表3表明，單用洗脫液1(10 mL甲醇)洗脫，對(duì)位紅的回收率較差，而用洗脫液1洗脫后再用洗脫液2(10 mL正己烷)洗脫，5種色素均能得到較好回收率。

表3 不同洗脫液對(duì)5種色素固相萃取回收率的影響

2.5 方法的線性及檢出限

將配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在濃度為0.5～50 mg·L-1的濃度范圍里，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的線性相關(guān) (表4)。方法的檢出限為 0.03 ～0.2 mg·kg-1。

2.6 方法回收率

采用辣椒醬和腐竹進(jìn)行不同添加濃度的樣品回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該方法具有良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，5種違禁色素回收率為82.5% ～96.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為1.0% ～3.5%(表5)。

表4 方法的線性及檢出限

表5 不同食品中5種色素的回收率

3 小結(jié)

本研究建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定食品中5種色素含量的方法。該方法線性關(guān)系良好，在0.5～50 mg·L-1范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為 0.999 8～0.999 9，方法的回收率為82.5% ～96.9%，精密度RSD為1.0%～3.5%，具有較高的準(zhǔn)確度和良好的重現(xiàn)性，可作為同時(shí)進(jìn)行食品中堿性嫩黃O、酸性橙II、堿性橙II、羅丹明B、對(duì)位紅含量測(cè)定的方法。

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