馬 旭，楊毅欣，王巖峰，安貴峰，商冠寧，呂 剛

(1.沈陽市骨科醫(yī)院,遼寧 沈陽 110044；2.中國醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 骨科，遼寧 沈陽 110001；3. Department of Biological Sciences, Emporia State University, Emporia, KS 66801, USA)

骨肉瘤是臨床常見的成骨性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%，其惡性程度高，易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后較差。近年來的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達與惡性腫瘤的生物學行為密切相關(guān)，特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。本實驗設計S100A4小發(fā)夾RNAi載體，干擾骨肉瘤細胞中的S100A4基因的表達，觀察干擾后骨肉瘤細胞生物學行為的變化以及對侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人骨肉瘤細胞系MG-63購自中科院上海細胞研究所。細胞培養(yǎng)條件：37℃, 5% CO2，DMEM/HIGH Glucose培養(yǎng)基+10%標準胎牛血清。

1.2 siRNA的設計與合成

依據(jù)Ambion公司提供的設計原則，根據(jù)S100A4基因在GenBank中的序列設計相應的siRNA。針對S100A4的siRNA載體委托閃晶生物公司構(gòu)建與合成。siRNA表達載體pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP綠色熒光標記，可以實時監(jiān)測載體在細胞中的轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)目的mRNA序列，設計3條RNA干擾靶序列及非特異性的siRNA(表1)。

1.3 細胞的分組及轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化并計數(shù)，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/ mL，取2 mL接種于六孔板，放置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在細胞達80%融合時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)提供的步驟進行。細胞分為如下幾組：C組(空白對照組)；C1組(轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組)；C2組(轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA組)；S1、S2、S3組(轉(zhuǎn)染特異性的siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組)。轉(zhuǎn)染24 h后，將培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，綠色熒光下觀察轉(zhuǎn)染情況。

表1 siRNA轉(zhuǎn)錄模板序列Tab 1 SiRNA transcribed template sequences

1.4 細胞總RNA提取和Real-time PCR反應

各組細胞使用Trizol試劑提取細胞總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄反應。Real-time PCR反應引物序列，目的基因S100A4：5'-GCCCTGGATGTGATGGTG-3′(上游)，5'-CGTTGTCCCTGTTGCTGT-′(下游)，擴增產(chǎn)物184 bp；內(nèi)參照β-actin：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′(上游)，5′-TCACCTTCACCGTTCCAG TTT-3′(下游)，擴增產(chǎn)物150 bp。使用SYBR?PremixExTaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa)進行Real-time PCR反應，反應條件：95℃，5 sec(1次)；95℃，5 sec；56℃，20 sec；68℃，15 sec(循環(huán)45次)。

1.5 應用Western-Blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后S100A4蛋白表達的變化

選取各組培養(yǎng)細胞制備蛋白質(zhì)樣品，用點式分光光度儀ND-1000 測定蛋白濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉封閉90 min，加入兔抗人S100A4一抗(1∶1500)，4℃過夜。將膜置于堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗(1∶20000)中室溫緩搖1 h，37℃恒溫箱孵育1 h，于膜的蛋白面滴加化學發(fā)光劑(ECL)顯色，同樣方法檢測內(nèi)參照β-actin。膠片曝光，顯影，定影。

1.6 MTT法測細胞增殖

實驗分為正常細胞組，陰性對照組和實驗組。正常細胞組為常規(guī)培養(yǎng)的MG-63；陰性對照組為非特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h；實驗組為特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h。以每孔104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)后第0、24、48、72、96 h，進行MTT反應，選擇490 nm波長，在紫外分光光度計上測定各孔吸光度，繪制細胞生長曲線。

1.7 平板克隆形成實驗

本實驗設置正常細胞組，陰性對照組和實驗組。正常細胞組為常規(guī)培養(yǎng)的MG-63；陰性對照組為非特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h；實驗組為特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h。將細胞懸液以50個/孔的細胞密度，接種于六孔板中培養(yǎng)14 d；倒置相差顯微鏡下觀察集落形成情況。判斷標準：含50個細胞以上的細胞集落為一集落，計算克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%)。

1.8 體外侵襲實驗

本實驗設置正常細胞組，陰性對照組和實驗組。正常細胞組為常規(guī)培養(yǎng)的MG-63；陰性對照組為非特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h；實驗組為特異性siRNA轉(zhuǎn)染后48 h。將Transwell小室(8 μm孔徑，Corning)放入培養(yǎng)板中，用50 mg/L Matrigel (BD)1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，取2×105/mL細胞200 μL加入上室，下室加入作為化學趨化物的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，37℃、5%CO2條件下孵育20 h。取出小室，棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽仔細擦凈膜上室面未侵襲的細胞，下室面用甲醇固定10 min后，0.1%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下隨機選取6個200×視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取均值。

1.9 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件處理，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染情況

倒置顯微鏡下可見各組細胞正常生長，熒光倒置顯微鏡下可見空白對照組(C組)、單純轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組(C1組)未見熒光，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(C2組)、轉(zhuǎn)染特異性siRNA組(S1、S2、S3組)可見綠色熒光，表達部位在細胞漿(圖1)。

2.2 Real-time PCR、Western-Blot檢測轉(zhuǎn)染效率

用雙標準曲線的方法比較各組S100A4基因的表達。C、C1、C2組S100A4基因的表達基本相似，差異無顯著性意義。S1、S2、S3組抑制效率分別達40%、37%和87%， S3組的作用更明顯。與C、C1、C2組比較，差異有顯著性意義，P<0.05(表2)。

2.3 Western-Blot檢測轉(zhuǎn)染后蛋白的表達

S1、S2、S3組的S100A4蛋白表達水平明顯低于C、C1、C2組，差異有顯著性意義，P<0.05。S1、S2、S3組干擾作用分別為 30.1%、22.2%、84.4%(表2，圖2)。

表2各組S100A4 mRNA以及蛋白表達水平

組別S100A4mRNA表達水平(S100A4/β-actin相對濃度比值)S100A4蛋白表達水平(S100A4/β-actin相對灰度比值)C1.00.7231±0.0226C11.0433±0.06030.7353±0.0472C20.9967±0.08510.7196±0.0325S10.6067±0.02521)0.5051±0.02481)S20.6467±0.03511)0.5624±0.03101)S30.1300±0.02001)2)0.1125±0.01711)2)

1)與C 、C1、C2組比較，P<0.05；2)與S1、S2組比較，P<0.05

從以上Real-time PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率結(jié)果可以得出，S3組抑制S100A4的表達作用更明顯。因此，接下來的實驗以S3組作為特異性siRNA轉(zhuǎn)染實驗組。

圖2應用Western-Blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后S100A4蛋白表達的變化

Fig 2 Application of Western-Blot method detects the changes of S100A4 protein expression before and after transfection

2.4 細胞增殖抑制實驗(MTT)

四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)實驗顯示，在相同的初始條件下，各組細胞增殖速度相近。24 h后，正常細胞組(0.233±0.0161)、陰性對照組細胞(0.2327±0.0186)增殖速度相近，實驗組(0.1823±0.0199)細胞增殖速度減慢，差異有顯著性意義(P<0.05)。隨著觀察時間延長，前兩組組間比較，增殖速度相似，差異無顯著性意義(P>0.05)；實驗組與前兩組比較，增殖速度明顯減慢，差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 RNA干擾前、后MG-63細胞增殖變化

Fig 3 The changes of MG-63 cell proliferation before and after RNA interference

2.5 平板克隆形成實驗

正常細胞組、陰性對照組的細胞生長狀態(tài)比較相似，而實驗組集落細胞形成相對減少，細胞生長緩慢。正常細胞組、陰性對照組及實驗組的克隆形成率分別為(18.00±1.63)%，(17.50±1.91)%，(10.00±1.63)%，后者與前兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)。

2.6 體外侵襲實驗

正常細胞組、陰性對照組及實驗組侵襲細胞的相對數(shù)目分別為34.00±2.72、34.61±3.11、19.50±1.89，后者與前兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲力的變化 (×200)Fig 4 Transwell chamber test detects the changes of cell invasion (×200)A: 正常細胞組; B: 陰性對照組； C: 實驗組A: Normal cells group； B: Negative control group； C: Experimental group

3 討 論

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展起來的研究生物體基因表達、調(diào)控與功能的一項新技術(shù)[1-3]。它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)引起的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性沉默現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對應的mRNA特異結(jié)合、降解，從而阻止mRNA的翻譯。RNAi普遍存在于各種生物，具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達mRNA的生物學功能。RNAi現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效抑制基因表達的技術(shù)手段，而且有助于在基因功能測定，基因治療等方面開辟一條新思路。S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員之一， S100蛋白被認為是一組鈣離子傳感器，通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導途徑在細胞增殖、分化、粘附、運動、基因表達及凋亡過程中發(fā)揮重要作用[4]。

本實驗根據(jù)S100A4基因的mRNA序列，設計3條RNA干擾靶序列及陰性對照，體外合成針對S100A4基因的siRNA 表達載體pSIREN-DNR，用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)入人骨肉瘤MG-63細胞中。應用Real-time PCR的方法檢測出在轉(zhuǎn)染特異性的siRNA后可以出現(xiàn)S100A4基因 mRNA表達的沉默。用Western-Blot的方法同樣檢測到了在轉(zhuǎn)染特異性的siRNA后即出現(xiàn)S100A4蛋白的下調(diào)，與轉(zhuǎn)染后mRNA的改變基本一致?？梢?，體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA能有效的實現(xiàn)對目的基因的干擾效應。本實驗設計合成的針對S100A4基因的siRNA 表達載體能夠?qū)崿F(xiàn)對S100A4基因表達的抑制作用。

本實驗MTT結(jié)果顯示，在相同的初始條件下，各組細胞增殖速度相近，隨著觀察時間延長特異性siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞生長明顯受到抑制；而平板克隆形成實驗結(jié)果同樣也表明：特異性siRNA轉(zhuǎn)染組集落細胞形成相對減少，細胞生長緩慢，提示干擾S100A4基因表達后抑制了細胞的增殖能力。

近期的研究表明，S100A4基因和蛋白的異常表達與惡性腫瘤的生物學行為密切相關(guān)，特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[5-6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S100A4在選取的骨肉瘤組織中有比較高的表達，而在對照組骨軟骨瘤中沒有表達，據(jù)此可推測骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與S100A4的異常表達有密切的關(guān)系[7]。作者發(fā)現(xiàn)，RNA干擾S100A4基因表達后穿過人工基底膜的細胞數(shù)量明顯減少，腫瘤細胞的運動侵襲能力明顯下降，說明抑制S100A4的表達降低了MG-63細胞的侵襲力，提示S100A4可能參與了腫瘤細胞侵襲力的調(diào)節(jié)。S100A4通過參與降低腫瘤細胞間粘附力、增加腫瘤細胞的運動能力、重塑細胞外基質(zhì)、抑制細胞凋亡、促進細胞異常增生、促進新生血管生成等各個階段，進而促進了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

RNA干擾技術(shù)為骨肉瘤的治療提供了一種新的思路，S100A4基因與骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，應用此技術(shù)抑制S100A4基因的表達可能成為骨肉瘤手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段，本研究為應用RNAi進行腫瘤的基因治療提供了實驗依據(jù)。

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