王 琰，趙學(xué)鋒，楊華英，時(shí)志民，駱志紅，孫 杰，張 巍

(1. 河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056002； 2. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北 邯鄲 056001； 3. 滄州河間市張茜榮診所，河北 滄州 062450)

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率上升為中國(guó)女性惡性腫瘤的第二位。腫瘤分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中信息傳遞中的一些障礙與腫瘤發(fā)生有關(guān)，這些控制細(xì)胞增殖、分化的信息傳遞通路中某一環(huán)節(jié)的異?？芍录?xì)胞生長(zhǎng)失控,最終導(dǎo)致腫瘤形成。本研究擬用免疫組化EliVisionTM檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中P-P38(磷酸化的P38)和NF-κB蛋白表達(dá)情況，分析這兩種蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為臨床治療和預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

選取2007年1月—2010年12月邯鄲市中醫(yī)院婦科子宮內(nèi)膜癌手術(shù)切除子宮標(biāo)本60例，平均年齡51.16歲，所有子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未行放、化療及激素治療。按2000年FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床病理分期及組織分級(jí):Ⅰ期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ期12例，Ⅳ期9例；G1級(jí)36例，G2級(jí)13例，G3級(jí)11例。病灶局限于黏膜層及浸潤(rùn)<1/2肌層44例，浸潤(rùn)>1/2肌層16例。取因子宮肌瘤或子宮脫垂而手術(shù)切除子宮的正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本32例，平均年齡47.32歲。

1.2 試劑與方法

組織芯片的制作：對(duì)每一組織標(biāo)本,均由兩位病理專家作兩次診斷，并在HE切片上根據(jù)典型病理部位作標(biāo)記即組織定位；制作微陣列蠟塊,先用空白石蠟塊,選用特殊工具在空白蠟塊上均勻地打出小孔(直徑1.0 mm), 然后根據(jù)HE片上精確范圍在供體組織蠟塊相應(yīng)位置獲取所要組織芯片放入受體蠟塊陣列孔中,并記錄組織編號(hào)，所有組織整齊排列,制成組織芯片蠟塊。對(duì)組織芯片蠟塊連續(xù)切片,制成組織芯片,均設(shè)有平行對(duì)照。

免疫組化方法：EliVisionTM試劑盒、二硝基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液及P-P38和NF-κB (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。采用微波EliVisionTM法, 參照文獻(xiàn)報(bào)道方法操作[1-2]，取已知切片作為陽性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

P-P38陽性定位于細(xì)胞核，NF-κB陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，以各種抗體在細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào)。每張切片均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×400)，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為(-)，5%～25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。以(+～+++)均視為陽性表達(dá)，(-)視為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)關(guān)系用等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

制作陣列蠟塊過程中有4片組織芯脫落,其他組織芯片排列整齊,92例標(biāo)本在組織芯片制備過程中片組織缺失(4.3%),無組織折疊,實(shí)際有效樣本68例,占總樣本量的95.7%。

2.1 P-P38和NF-κB在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況

32例正常子宮內(nèi)膜組織未發(fā)現(xiàn)P-P38蛋白表達(dá)，60例子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)33例，表達(dá)率為55.00% (33/60)，兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)。32例正常的子宮內(nèi)膜組織中NF-κB陽性表達(dá)4例，60例子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)36例，表達(dá)率為60.00%(36/60),兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1，圖1、2。

圖1 P-P38在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)(SP×400) Fig 1 Expression of P-P38 in endometrial carcinoma(SP×400)

圖2 NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)(SP×400) Fig 2 Expression of NF-κB in endometrial carcinoma(SP×400)

2.2 P-P38和NF-κB在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

P-P38和NF-κB在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床病理分期、肌層浸潤(rùn)深度以及淋巴道轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；而與組織學(xué)類型無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 P-P38和NF-κB蛋白在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織比較，P<0.05；子宮內(nèi)膜癌各組織學(xué)分級(jí)間及不同病理分期間比較，P均<0.05

2.3 P-P38和NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中的相關(guān)性分析

P-P38和NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.561，P<0.05)，見表2。

表2 P-P38和NF-κB蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的相關(guān)性

r=0.561,P<0.05

3 討 論

MAPK(絲裂原活化蛋白激酶，mitogen-activated protein kinases)是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化前的MAPK位于胞漿，一旦活化即進(jìn)入核內(nèi)激活靶基因。MAPK通路信號(hào)的傳送是通過MAPKKK、MAPKK和MAPK連續(xù)的磷酸化作用實(shí)現(xiàn)的[3]。已發(fā)現(xiàn)4條MAPK信號(hào)通路：ERK、JNK、BMK及P38MAPK。P38MAPK[4]作為MAPK家族中重要的成員傳導(dǎo)通路是由360個(gè)氨基酸組成的酪氨酸磷酸化蛋白激酶，其分子量為38 kD，屬于應(yīng)激激活的蛋白，在多種生長(zhǎng)因子、炎癥因子和應(yīng)激反應(yīng)作用下激活。P38發(fā)生磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，影響基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡[5]。本研究采用微波EliVisionTM免疫組織化學(xué)分析磷酸化P38 (P-P38)在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)情況，結(jié)果顯示陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核內(nèi)，在子宮內(nèi)膜癌組織中呈過度表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜組織中不表達(dá)，差異有顯著性意義(P<0.05)，P-P38與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、浸潤(rùn)深度及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，與腫瘤的病理組織類型無關(guān)(P>0.05)，提示P-P38的過度表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。

NF-κB是1986年由Sen和Baltimore首次發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因其能與B細(xì)胞中免疫球蛋白K氫鏈增強(qiáng)子結(jié)合并具有結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄激活活性而被命名。NF-κB可以與 DNA 結(jié)合，直接調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可以與體內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)接，參與炎癥，免疫，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡等多種生理、病理過程的基因調(diào)控[6]。在靜息狀態(tài)下, NF-κB 與其抑制劑IκB 結(jié)合，沒有生物活性。當(dāng)胞內(nèi)外的刺激因素作用于IκB 激酶(IKK)后，引起了 IκB 的降解，NF-κB 的核定位信號(hào)得以重新暴露，并介導(dǎo) NF-κB 的核轉(zhuǎn)位，入核后的 NF-κB 與靶基因的 κB 位點(diǎn)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[7]?；罨?NF-κB 通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)腫瘤的形成與惡化。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，并且NF-κB的陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、浸潤(rùn)深度及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05)，提示NF-κB在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用。

在對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織中P-P38和NF-κB的陽性表達(dá)相關(guān)性分析中，發(fā)現(xiàn)P-P38和NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同促進(jìn)作用。其機(jī)制可能是MAPKK/MAPK通路的下游底物有IκB激酶活性[8]，使IκB 降解，NF-κB 的核定位信號(hào)得以重新暴露，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。

總之，子宮內(nèi)膜癌組織中P-P38蛋白和NF-κB蛋白處于過表達(dá)狀態(tài)，與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步解析子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制，以利于在不同層次阻斷子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為子宮內(nèi)膜癌防治探索新思路。

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