王長(zhǎng)松，田莉莉，張俊剛，季祥武，趙廣榮

〔1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(教育部)，天津300072;2.濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濰坊261041〕

五種中藥酚酸類(lèi)化合物體外抗DNA損傷的作用

王長(zhǎng)松1，田莉莉1，張俊剛2，季祥武2，趙廣榮1

〔1.天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(教育部)，天津300072;2.濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東濰坊261041〕

目的探究中藥酚酸類(lèi)化合物抑制DNA損傷的效應(yīng)，分析其構(gòu)效關(guān)系。方法以人工合成抗氧化劑水溶性維生素E Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，選取結(jié)構(gòu)相近的沒(méi)食子酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸和對(duì)香豆酸5種天然酚酸類(lèi)化合物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其體外清除羥自由基、過(guò)氧自由基及過(guò)氧亞硝基陰離子從而抑制DNA氧化損傷的作用。對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算開(kāi)環(huán)態(tài)DNA所占百分比，由此得出各化合物的IC50值。結(jié)果5種酚酸類(lèi)化合物均表現(xiàn)出抑制DNA損傷的作用，開(kāi)環(huán)態(tài)DNA所占百分比隨藥物濃度增加而減少。5種化合物可抑制羥自由基引起的DNA損傷，IC50值分別為:沒(méi)食子酸(1.13±0.03)mmol·L－1≈咖啡酸(1.14±0.07)mmol·L－1＜對(duì)香豆酸(1.41±0.06)mmol·L－1＜芥子酸(1.68±0.04)mmol·L－1＜阿魏酸(1.80±0.04)mmol·L－1＜Trolox(3.42±0.03)mmol·L－1;抑制過(guò)氧自由基引起的DNA損傷，IC50值分別為:沒(méi)食子酸(0.12±0.02)mmol·L－1＜咖啡酸(0.14±0.03)mmol·L－1＜對(duì)香豆酸(0.17±0.08)mmol·L－1＜芥子酸(0.20±0.05)mmol·L－1＜阿魏酸(0.26±0.07)mmol·L－1＜Trolox(0.52±0.06)mmol·L－1;抑制過(guò)氧亞硝基陰離子引起的DNA損傷，IC50值分別為:芥子酸(0.81±0.01)mmol·L－1＜沒(méi)食子酸(0.90±0.01)mmol·L－1＜阿魏酸(1.20±0.02)mmol·L－1＜對(duì)香豆酸(1.62±0.02)mmol·L－1≈咖啡酸(1.71±0.03)mmol·L－1＜Trolox(3.38±0.07)mmol·L－1。結(jié)論該五種中藥酚酸類(lèi)化合物均具有抑制羥自由基、過(guò)氧自由基及過(guò)氧亞硝基引起的DNA損傷的作用，隨相鄰羥基數(shù)量增加，化合物抑制羥自由基和過(guò)氧自由基引起的DNA氧化損傷作用加強(qiáng)，而側(cè)鏈-CH=CHCOOH和對(duì)位供電子基團(tuán)能增強(qiáng)化合物抑制過(guò)氧亞硝基陰離子引起的DNA氧化損傷作用。

酚酸類(lèi);羥自由基;過(guò)氧自由基;過(guò)氧亞硝基陰離子;構(gòu)效關(guān)系

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到危害人類(lèi)健康的重大疾病如癌癥、心腦血管疾病和帕金森綜合征等均與DNA損傷有著密切的關(guān)系［1］。細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的活性氧，如羥自由基、超氧陰離子和過(guò)氧亞硝基陰離子等，是造成DNA等生物大分子氧化損傷的主要來(lái)源［2］。有效清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，保護(hù)DNA免受氧化損傷，可以預(yù)防上述疾病的發(fā)生［3］。酚酸類(lèi)化合物廣泛存在于丹參、當(dāng)歸和川芎等中藥和葡萄等水果［4］中，具有很強(qiáng)的抗氧化活性和清除活性氧的能力［5－6］，具有治療和預(yù)防心血管疾病、延緩衰老和抗癌等藥理作用。本課題組曾用丹參素建立了熒光檢測(cè)篩選抗DNA畸變藥物模型［7］。本研究選取了沒(méi)食子酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸和對(duì)香豆酸5種中藥酚酸類(lèi)化合物(圖1)，并以人工合成抗氧化劑Trolox(水溶性維生素E)作為陽(yáng)性對(duì)照，研究其在體外清除羥自由基、過(guò)氧自由基和過(guò)氧亞硝基陰離子從而保護(hù)DNA分子免受氧化損傷的作用，并探討其構(gòu)效關(guān)系。

Fig.1 Structures of five natural phenolic acids and Trolox.

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

咖啡酸(≥99%)和Trolox(≥99%)購(gòu)自Sigma公司;沒(méi)食子酸(＞98%)和對(duì)香豆酸(＞98%)購(gòu)自陜西寶雞辰光生物有限公司;阿魏酸(＞98%)和芥子酸(＞98%)購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司。2，2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽〔2，2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH〕購(gòu)自上?？笊锛夹g(shù)有限公司;5-氨基-3-(4-嗎啉基)-1，2，3-噁二唑鎓鹽酸鹽(5-amino-3-morpholinyl-1，2，3-oxadiazolium chloride，SIN-1)購(gòu)自Cayman公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司，用于從大腸桿菌中提取pUC18質(zhì)粒;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。DYY-6C型電泳儀:北京六一儀器廠;ND-1000微量紫外分光光度計(jì):德國(guó)Thermo Scientific公司;紫外凝膠成像系統(tǒng):美國(guó)UVP公司。

1.2 抑制羥自由基引起的DNA損傷作用的檢測(cè)

在離心管中依次加入0.8 μg超螺旋態(tài)質(zhì)粒DNA，Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L－1，pH 7.0)及受試化合物0，0.5，1，2，3，4和6 mmol·L－1，充分混勻，再加入Fenton反應(yīng)試劑(FeSO425 μmol·L－1，H2O2100 μmol·L－1)，最終體積為10 μl，于室溫下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳。用溴化乙錠染色凝膠后，用紫外凝膠成像系統(tǒng)照相并保存。用Labworks4.0軟件對(duì)電泳圖中各泳道的兩條DNA帶進(jìn)行吸光度分析，參考文獻(xiàn)［8］中的方法以空白對(duì)照(未處理的超螺旋質(zhì)粒DNA)做修正，按下式計(jì)算實(shí)驗(yàn)組抑制DNA損傷百分?jǐn)?shù)，以表征受試化合物抑制DNA損傷的能力。由于超螺旋態(tài)DNA比開(kāi)環(huán)態(tài)不易被溴化乙錠染色，因此超螺旋態(tài)條帶吸光度乘以校正因子1.24，再計(jì)算兩條帶吸光度各占該泳道的相對(duì)百分比。

開(kāi)環(huán)態(tài)DNA百分比(%)=〔開(kāi)環(huán)態(tài)DNA吸光度×1.24/(開(kāi)環(huán)態(tài)DNA吸光度×1.24+超螺旋態(tài)DNA吸光度)〕×100%;抑制DNA損傷百分率(%)=〔1－(加入藥品組開(kāi)環(huán)態(tài)DNA所占百分比/損傷組開(kāi)環(huán)態(tài)DNA所占百分比)〕×100%。其中損傷組為加入藥品濃度為0的陰性對(duì)照組。每組至少重復(fù)3次，取平均值，采用Origin7.5軟件作圖并用S擬合，獲得R2＞0.98的擬合曲線(xiàn)，求出受試化合物的IC50值。

1.3 抑制AAPH引起的DNA損傷作用的檢測(cè)

在離心管中依次加入0.8 μg超螺旋態(tài)質(zhì)粒DNA，受試化合物0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6和1 mmol·L－1，充分混勻，再加入AAPH 160 mmol·L－1(由PBS緩沖液稀釋?zhuān)琾H 7.2)，最終體積為10 μl，于37℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，按上述方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)電泳圖中各泳道的兩條DNA帶進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組抑制DNA損傷百分率。每組至少重復(fù)3次，取平均值，采用Origin7.5軟件作圖并用S擬合，獲得R2＞0.98的擬合曲線(xiàn)，求出受試化合物的IC50值。

1.4 抑制SIN-1引起的DNA損傷作用的檢測(cè)

在離心管中依次加入0.8 μg超螺旋態(tài)質(zhì)粒DNA，與受試化合物0，0.1，0.5，1，2，4和6 mmol·L－1充分混勻，再加入SIN-1 2 mmol·L－1(由PBS緩沖液稀釋?zhuān)琾H 7.2)，最終體積為10 μl，于37℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，按上述方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)電泳圖中各泳道的兩條DNA帶進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組抑制DNA損傷百分率。每組至少重復(fù)3次，取平均值，采用Origin7.5軟件作圖并用S擬合，獲得R2＞0.98的擬合曲線(xiàn)，求出受試化合物的IC50值。

2 結(jié)果

2.1 酚酸類(lèi)化合物抑制羥自由基對(duì)DNA的損傷

圖2為沒(méi)食子酸實(shí)驗(yàn)組凝膠電泳結(jié)果。由圖3可見(jiàn)，沒(méi)食子酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對(duì)香豆酸和Trolox均表現(xiàn)出抑制羥自由基對(duì)DNA損傷的作用，而且具有濃度依賴(lài)效應(yīng)(R2＞0.98，P＜0.05)，隨著酚酸類(lèi)化合物濃度的升高，DNA損傷程度減弱。受試化合物抑制DNA損傷的IC50值見(jiàn)表1。抑制羥自由基對(duì)DNA損傷的作用由強(qiáng)到弱依次為:沒(méi)食子酸≈咖啡酸＞對(duì)香豆酸＞芥子酸＞阿魏酸＞Trolox。其中沒(méi)食子酸和咖啡酸清除羥自由基的作用最強(qiáng)，約為T(mén)rolox的3倍。

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of gallic acid protecting aginst supercoiled plasmid DNA damage from hydroxyl radicals.Gallic acid，supercoiled DNA and Fen ton reagents were incubated for 30 min at room temperature，following electrophoresis on 1%of agarose gel in TAE buffer.Lane 1:supercoiled plasmid DNA;lane 2:supercoiled plasmid DNA+Fenton reagents(FeSO425 μmol·L－1，H2O2 100 μmol·L－1)(negative control);lanes 3－8:supercoiled plasmid DNA+Fenton reagents+gallic acid at concentrations of 0.5，1，2，3，4 and 6 mmol·L－1，respectively.

Fig.3 Protective effect of gallic acid，caffeic acid，ferulic acid，sinapic acid，p-coumaric acid and Trolox against plasmid DNA damage induced by hydroxyl radicals.The tested compounds incubated with supercoiled plasmid DNA for 30 min at room temperature.The percent inhibition of DNA damage was measured using electrophoresis of agarose gel.Inhibitory rate of DNA damage(%)=〔1－(A/B)〕×100%，where A is the percentage of the nicked DNA with the tested compounds;B is the percentage of the nicked DNA without the tested compounds.

Tab.1 IC50values for scavenging various radicals of five natural phenolic acids

2.2 酚酸類(lèi)抑制過(guò)氧自由基損傷DNA的效應(yīng)

沒(méi)食子酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對(duì)香豆酸和Trolox抑制過(guò)氧自由基所致DNA損傷的作用見(jiàn)圖4。5種酚酸類(lèi)化合物均表現(xiàn)出抑制過(guò)氧自由基損傷DNA的作用，且具有明顯的濃度依賴(lài)性(R2＞0.98，P＜0.05)。各化合物抑制DNA過(guò)氧自由基損傷的IC50值見(jiàn)表1，沒(méi)食子酸的保護(hù)效應(yīng)最強(qiáng)，約為T(mén)rolox的4.3倍。各化合物清除過(guò)氧自由基的作用由強(qiáng)到弱依次為:沒(méi)食子酸＞咖啡酸＞對(duì)香豆酸＞芥子酸＞阿魏酸＞Trolox，該順序與清除羥自由基抑制DNA損傷的作用基本一致。

2.3 酚酸類(lèi)抑制過(guò)氧亞硝基陰離子損傷DNA的效應(yīng)

Fig.4 Protective effect of gallic acid，caffeic acid，ferulic acid，sinapic acid，p-coumaric acid and Trolox against plasmid DNA damage induced by 2，2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride(AAPH).The tested compounds incubated with the supercoiled plasmid DNA and AAPH 160 mmol·L－1for 2 h at 37℃.

Fig.5 Protective effect of gallic acid，caffeic acid，ferulic acid，sinapic acid，p-coumaric acid and Trolox against plasmid DNA damage induced by ONOO－.The tested compounds incubated with the supercoiled plasmid DNA and amino-3-morpholinyl-1，2，3-oxadiazolium chloride(SIN-1)2 mmol·L－1for 2 h at 37℃.

如圖5所示，沒(méi)食子酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對(duì)香豆酸和Trolox具有清除ONOO－、保護(hù)DNA免受氧化損傷的能力，具有明顯的濃度依賴(lài)性(R2＞0.98，P＜0.05)。各受試化合物抑制ONOO－損傷DNA的IC50值見(jiàn)表1。與清除羥自由基和過(guò)氧自由基的作用存在明顯差異，保護(hù)ONOO－所致的DNA損傷的作用由強(qiáng)到弱依次為:芥子酸＞沒(méi)食子酸＞阿魏酸＞對(duì)香豆酸≈咖啡酸＞Trolox。其中芥子酸表現(xiàn)出了很強(qiáng)的保護(hù)DNA免受ONOO－損傷的作用，約為T(mén)rolox的4.2倍;咖啡酸的抑制作用最弱，僅為T(mén)rolox的2.0倍。

3 討論

酚酸類(lèi)化合物主要是通過(guò)遞氫反應(yīng)來(lái)清除Fenton反應(yīng)引發(fā)的羥自由基和AAPH引發(fā)生產(chǎn)的過(guò)氧自由基，起到抗氧化作用。同時(shí)，研究表明酚酸類(lèi)化合物可以通過(guò)遞氫的方式直接與DNA被氧化后所形成的自由基作用［9］。酚酸類(lèi)化合物傳遞出氫原子后自身成為相對(duì)穩(wěn)定的苯氧自由基，從而終止自由基引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到清除自由基的作用。因此，酚酸類(lèi)化合物遞氫能力及所形成的苯氧自由基的穩(wěn)定性很大程度上決定了其抗氧化能力。

本研究結(jié)果表明，5種中藥酚酸類(lèi)化合物清除羥自由基與過(guò)氧自由基的作用大小順序基本一致，即沒(méi)食子酸最強(qiáng)，咖啡酸次之，阿魏酸最弱，但均強(qiáng)于Trolox。沒(méi)食子酸分子中具有3，4，5-三羥基結(jié)構(gòu)，在所有化合物中含有的酚羥基數(shù)目最多，遞氫能力最強(qiáng)，在受試的酚酸類(lèi)化合物中抗氧化能力也最強(qiáng)。同時(shí)，沒(méi)食子酸中1位的COOH基團(tuán)具有吸電子能力，會(huì)減弱4位羥基的遞氫作用，所以在3，4，5位的三個(gè)羥基中只有3，5位的羥基遞氫能力較強(qiáng)，因此沒(méi)食子酸清除羥自由基的能力與咖啡酸接近?？Х人峋哂?，4-二羥基結(jié)構(gòu)，且1位是-CH=CHCOOH基團(tuán)。由于-CH=CHCOOH的供電子效應(yīng)使4位羥基的遞氫作用強(qiáng)于3位羥基。4位羥基遞氫之后形成的單電子可以通過(guò)乙烯橋增強(qiáng)穩(wěn)定性，同時(shí)3位羥基的氫原子可以與4位氧原子形成分子內(nèi)氫鍵，能夠穩(wěn)定氧原子上的單電子［9］，并且容易生成穩(wěn)定的半醌式自由基，使咖啡酸具有較強(qiáng)的清除氧自由基的能力。對(duì)香豆酸、芥子酸和阿魏酸均只有一個(gè)酚羥基，三者中以對(duì)香豆酸清除氧自由基的能力最強(qiáng)，阿魏酸最弱。這與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的關(guān)于咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等抑制由AAPH所致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的效應(yīng)大小次序相同。

由SIN-1引發(fā)的ONOO－不同于羥自由基和過(guò)氧自由基之處是ONOO－具有氧化和硝化等復(fù)雜的反應(yīng)特性。因此，在考察酚酸類(lèi)化合物清除ONOO－的能力時(shí)，不能只考慮酚酸類(lèi)化合物的抗氧化性，也需要考慮酚酸類(lèi)化合物的抗硝化等性質(zhì)。在受試的5種天然化合物中，芥子酸對(duì)ONOO－引起的DNA氧化損傷的抑制作用最強(qiáng)。由于原子的空間位阻和自由基的取向，芥子酸與ONOO－的反應(yīng)并不發(fā)生在芳環(huán)上，而是通過(guò)單電子氧化在側(cè)鏈發(fā)生二聚［11］，這種二聚物的生成使得芥子酸清除ONOO－的能力增強(qiáng)。Kerry等［12］研究表明，阿魏酸和對(duì)香豆酸也能在不同程度上發(fā)生二聚。形成這種二聚物首先需要含有-CH=CHCOOH側(cè)鏈基團(tuán)，同時(shí)，為了使電子能轉(zhuǎn)移到側(cè)鏈上，最好在另一端含有給電子基團(tuán)，如烷氧基，而避免含有吸電子基團(tuán)，如羥基。因此，芥子酸清除ONOO－的能力強(qiáng)于阿魏酸，而阿魏酸又強(qiáng)于對(duì)香豆酸。沒(méi)食子酸由于含有三聯(lián)酚羥基結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的清除ONOO－的能力，咖啡酸由于不能生成側(cè)鏈二聚物，而表現(xiàn)出較弱的抗ONOO－氧化損傷DNA的能力。

5種中藥酚酸類(lèi)化合物均表現(xiàn)出抑制自由基引起的DNA損傷的作用，且優(yōu)于Trolox。多羥基的酚酸類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的清除羥自由基和過(guò)氧自由基的能力，側(cè)鏈含有-CH=CHCOOH且對(duì)位為供電子基團(tuán)的酚酸類(lèi)具有較強(qiáng)的清除過(guò)氧亞硝基陰離子的能力。在5種酚酸物中，沒(méi)食子酸是兼具清除羥自由基、過(guò)氧自由基及ONOO－最好的化合物。本研究所采用的體外研究酚酸類(lèi)化合物抑制自由基引起的DNA氧化損傷效應(yīng)的方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果可靠，可用于抗癌中藥的早期研發(fā)和篩選。

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Protective effect of five natural phenolic acids against DNA oxidative damage in vitro

WANG Chang-song1，TIAN Li-li1，ZHANG Jun-gang2，JI Xiang-wu2，ZHAO Guang-rong1
〔1.Key Laboratory of System Bioengineering(Ministry of Education)，Department of Pharmaceutical Engineering，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin300072;2.Department of Cardiology，Weifang People's Hospital，Weifang261041，China〕

OBJECTIVETo investigate the effect of natural phenolic acids compounds on free radicals induced DNA damage and to analyze the structure-activity relationship of these compounds.METHODSFive structurally relevant phenolic acids were selected:gallic acid，caffeic acid，sinapic acid，ferulic acid and p-coumaric acid.The synthetic antioxidant Trolox was used as positive control.The protective effect against hydroxyl radicals，peroxyl radicals and peroxynitriteinduced DNA damage were evaluated by agarose gel electrophoresis(AGE).The IC50of compounds was obtained by calculating the percentage of the nicked DNA based on densitometry analysis of AGE images.RESULTSAll the five natural phenolic acids protected DNA from oxidative damage in a concentration-dependent manner.The IC50against hydroxyl radicals was listed as follows:gallic acid(1.13±0.03)mmol·L－1≈caffeic acid(1.14±0.07)mmol·L－1＜p-coumaric acid(1.41±0.06)mmol·L－1＜sinapic acid(1.68±0.04)mmol·L－1＜ferulic acid(1.80±0.04)mmol·L－1＜Trolox(3.42±0.03)mmol·L－1.For peroxyl radicals，the IC50was listed as follows:gallic acid(0.12±0.02)mmol·L－1＜caffeic acid(0.14±0.03)mmol·L－1＜p-coumaric acid(0.17±0.08)mmol·L－1＜sinapic acid(0.20±0.05)mmol·L－1＜ferulic acid(0.26±0.07)mmol·L－1＜Trolox(0.52±0.06)mmol·L－1.For peroxynitrites，the IC50was listed as follows:sinapic acid(0.81±0.01)mmol·L－1＜gallic acid(0.90±0.01)mmol·L－1＜ferulic acid(1.20±0.02)mmol·L－1＜p-coumaric acid(1.62±0.02)mmol·L－1≈caffeic acid(1.71±0.03)mmol·L－1＜Trolox(3.38±0.07)mmol·L－1.CONCLUSIONThe five natural phenolic acids can inhibit DNA damage induced by hydroxyl radicals，peroxyl radicals and peroxynitrites.The activities of scavenging hydroxyl radicals and peroxyl radicals increase with the number of adjacent hydroxyls while the side chain-CH=CHCOOH and electron-donating groups in para-position can strengthen the activity of scavenging peroxynitrites.

phenolic acids;hydroxyl radical;peroxyl radical;peroxynitrites;structure-activity relationship

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30873400)

ZHAO Guang-rong，E-mail:grzhao@tju.edu.cn，Tel:(022)27405790

R282.5

A

1000-3002(2012)04-0529-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.011

國(guó)家自然科學(xué)基金(30873400)

王長(zhǎng)松(1988－)，男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物制藥研究;趙廣榮(1966－)，男，博士，教授，主要從事合成生物學(xué)與天然產(chǎn)物制藥研究。

趙廣榮，E-mail:grzhao@tju.edu.cn，Tel:(022)27405790

2011-11-18接受日期:2012-04-27)

(本文編輯:齊春會(huì))