藍(lán) 慶 楊建明 華 為

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.浙江省農(nóng)科院國(guó)家大麥改良中心，浙江 杭州 310021)

大麥?zhǔn)俏覈?guó)以及世界上重要的農(nóng)作物之一，其種植面積和產(chǎn)量位列第四，是啤酒工業(yè)與飼料工業(yè)的主要原料。利用植物基因工程的原理和技術(shù)對(duì)大麥進(jìn)行改良，已經(jīng)引起了人們的高度重視，它將成為優(yōu)質(zhì)大麥新品種培育的有效新途徑之一[1-6]。與水稻、玉米等其他主要農(nóng)作物相比，大麥的組織培養(yǎng)、植株再生非常困難，且遺傳轉(zhuǎn)化效率非常低，這嚴(yán)重阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在培育大麥新品種的應(yīng)用。所以，尋求高效能提升大麥組織培養(yǎng)再生率和遺傳轉(zhuǎn)化率的方法，是大麥遺傳轉(zhuǎn)化研究工作的重點(diǎn)。本文利用30個(gè)大麥品種對(duì)成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率和植株分化再生率等進(jìn)行了研究，篩選出了大麥高組培再生率品種，對(duì)大麥遺傳轉(zhuǎn)化改良研究中品種的選擇提供了一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料有30個(gè)大麥品種：sloop、Golden promise、Metcalfe、Baudin、Gairdner、Franklin、Hamelin、Igri、Morex、云啤2號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤9號(hào)、08PJ-37青、蘇啤3號(hào)、蘇啤3號(hào)白、08PJ-37黃、浙啤33、浙大8號(hào)、浙秀12、浙秀22、浙皮8號(hào)、駐大麥5號(hào)、甘啤4號(hào)、甘啤5號(hào)、花30、墾啤麥9號(hào)、單二、秀麥11、揚(yáng)飼麥3號(hào)、保大麥12號(hào)、短芒紫青稞。以上品種均由浙江省農(nóng)科院國(guó)家大麥改良中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

所有培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH值至5.8，無(wú)機(jī)成分和糖分均高壓蒸汽滅菌，于121℃和0.1Mpa壓力下滅菌25min。所有其余有機(jī)成分均在無(wú)菌條件下過(guò)濾滅菌，且在培養(yǎng)基冷卻至60℃以下加入。

1.3 取材與培養(yǎng)方法

將所有供試材料，用篩種機(jī)過(guò)篩，選取粒徑2.5mm級(jí)別的材料，浸泡10h，隨后置于50%(V/V)硫酸溶液中，搖床振蕩40min。將去殼的種子用75%乙醇消毒5min，12%過(guò)氧化氫溶液消毒25min，最后用滅菌水沖洗4次，每次1min。然后在無(wú)菌條件下，用解剖刀刮取種子成熟胚，將刮碎的胚組織接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25℃黑暗條件下誘導(dǎo)13d后，將初代愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基暗培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)到MS修飾培養(yǎng)基1上暗培養(yǎng)10d，最后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS修飾培養(yǎng)基2上進(jìn)行光照分化培養(yǎng)(25℃、2000lx，16h/d),培養(yǎng)基種類見(jiàn)表1，30d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 培養(yǎng)基種類 mg

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

每皿接種12個(gè)外植體，每個(gè)處理接種200個(gè)。每個(gè)品種3次重復(fù)。

愈傷誘導(dǎo)率(%)=(出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100

分化率(%)=(分化愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù))×100

再生率(%)=(出苗數(shù)/接種愈傷數(shù))×100

綠苗率(%)=(綠苗數(shù)/接種愈傷數(shù))×100

白化苗率(%)=(白化苗數(shù)/接種愈傷數(shù))×100

將誘導(dǎo)率等百分?jǐn)?shù)先用Excel進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換，再采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大麥品種成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)

大麥成熟胚刮碎的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3d時(shí)，開(kāi)始變白膨大，出現(xiàn)初級(jí)愈傷組織(圖1)。6d后刮碎接種的外植體形成愈傷組織團(tuán)塊，在12d時(shí)愈傷組織形成可達(dá)到最大。初級(jí)愈傷組織一般為半透明白色，結(jié)構(gòu)松軟，多成不規(guī)則片狀或球狀，含水量豐富，不具備分化再生能力。經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的愈傷組織才具備分化、再生的能力。經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)的愈傷組織形成淡黃色球狀，表面呈現(xiàn)許多疣狀突起的胚性愈傷組織[7]。胚性愈傷組織具有分化和再生的能力。不同大麥品種成熟胚愈傷組織出愈率差異顯著(表2，表3)，所有供試材料中共有27個(gè)品種的出愈率超過(guò)60%，其中Golden promise、Hamelin、08PJ-37青、云啤2號(hào)和Morex的愈傷誘導(dǎo)率最高分別達(dá)到了93.4%、94.05%、94.75%、94.8%、94.95%，而短芒紫青稞的出愈率最低，僅為5.3%。

圖1 初代愈傷組織(彩圖見(jiàn)封2)

圖2 分化帶綠點(diǎn)的愈傷(彩圖見(jiàn)封2)

圖3 再生成苗(彩圖見(jiàn)封2)

表2 不同大麥品種成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的比較

表3 成熟胚出愈率的方差分析

2.2 不同大麥品種成熟胚愈傷組織分化和再生

在N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的初代愈傷組織，轉(zhuǎn)移到MS繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行10d的暗培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)移到MS修飾培養(yǎng)基1上預(yù)分化處理10d。最后在MS修飾培養(yǎng)基2上光照條件下進(jìn)行分化。在光照下1周，胚性愈傷組織表面分化出綠點(diǎn)(圖2)，繼續(xù)培養(yǎng)2周，其中一部分可以繼續(xù)分化形成綠苗(圖3)；而另一些愈傷組織只能保持綠點(diǎn)的狀態(tài)或者分化成根，不會(huì)分化成苗。不同大麥品種的分化率、再生率、綠苗形成率以及白化率均有顯著差異(見(jiàn)表4～8)。所有供試材料中共有24個(gè)品種的分化率超過(guò)50%，其中Franklin、蘇啤3號(hào)和浙秀22的分化率較高，分別達(dá)到了93.05%、96.3%、97.6%，而駐大麥5號(hào)的分化率最低，僅為11.85%,參見(jiàn)表4、表5。

在再生能力方面，不同品種間的大麥具有顯著差異。共有3個(gè)品種的再生率超過(guò)40%，6個(gè)品種再生率在30%～40%之間，6個(gè)品種在20%～30%之間，7個(gè)品種在10%～20%之間，8個(gè)品種的再生率在10%以下。其中sloop、揚(yáng)農(nóng)啤9號(hào)、Golden promise的再生率較高，分別達(dá)到了40.6%、43.85、44.7%，而再生率最低的墾啤麥9號(hào)僅為1.4%，參見(jiàn)表6、表7。

在愈傷組織分化培養(yǎng)的過(guò)程中，有6個(gè)品種的綠苗率在30%以上，6個(gè)品種在20%～30%之間，9個(gè)品種在10%～20%之間，9個(gè)品種的綠苗率在10%以下。其中，sloop的綠苗率最高，達(dá)到了40.6%。而綠苗率最低的墾麥啤9號(hào)僅為1.05%。

產(chǎn)生綠苗的同時(shí)會(huì)伴有白化苗的生成，對(duì)供試材料的白化率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)共有24個(gè)大麥品種的愈傷組織可以產(chǎn)生白化苗，揚(yáng)農(nóng)啤9號(hào)、08PJ-37青、Franklin、浙秀12、Golden promise的白化率分別為13.25%、9.85%、6.15%、5.85%、3.9%，其余品種的白化率均低于3%，參見(jiàn)表8。

2.3 成熟胚愈傷組織出愈率、分化率、再生率、綠苗率的相關(guān)性分析。

將以上所有各比率用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析(見(jiàn)表9)，發(fā)現(xiàn)出愈率與分化率之間的相關(guān)性達(dá)到了極顯著的水平，而出愈率與再生率以及綠苗率沒(méi)有相關(guān)性。分化率與再生率之間的相關(guān)性達(dá)到了顯著水平，分化率與綠苗率之間的相關(guān)性也達(dá)到顯著水平，再生率與綠苗率之間達(dá)到了極顯著水平的相關(guān)性。

綜合分析，品種Golden promise、浙皮8號(hào)、浙秀12、Metcalfe、Franklin、浙大8號(hào)六個(gè)品種的成熟胚組織培養(yǎng)再生能力較強(qiáng)，可以作為大麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行利用。

表4 不同大麥品種成熟胚愈傷組織分化的比較

表5 成熟胚分化率的方差分析

表6 不同大麥品種成熟胚愈傷組織再生的比較

表7 成熟胚再生率、綠苗率的方差分析

表8 不同大麥品種成熟胚愈傷組織綠苗、白化苗的比較

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同的大麥基因型成熟胚具有不同的愈傷組織誘導(dǎo)力。總體上說(shuō)，大麥成熟胚的誘導(dǎo)率都高于60%。在30個(gè)品種中，出愈率高于80%的品種就有16個(gè)。郭曉琳等[9]的研究表明，在大麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)過(guò)程中，較高濃度的KH2PO4以及VB1可促進(jìn)誘導(dǎo)出愈傷組織。本實(shí)驗(yàn)采用的N6培養(yǎng)基輔以10mg/L的VB1獲得了較高的出愈率，證明了對(duì)于大麥成熟胚的組織培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，KH2PO4和VB1可能是兩個(gè)關(guān)鍵因素，對(duì)未來(lái)大麥成熟胚的組培研究提供了思路。

共有24個(gè)大麥品種的分化率超過(guò)了50%，最高的浙秀22達(dá)到了較高的97.6%。預(yù)分化培養(yǎng)基的設(shè)置，以及所含的激素配比，可能對(duì)大麥成熟胚的愈傷組織分化起到了作用。

所有的供試品種都有綠苗的再生。Sloop、Golden promise、浙啤8號(hào)、Metcalfe、甘啤4號(hào)、揚(yáng)農(nóng)啤9號(hào)等品種的綠苗率超過(guò)了30%，魏日鳳[8]研究了蔗糖與麥芽糖的配比對(duì)水稻成熟胚培養(yǎng)的作用，當(dāng)有適當(dāng)比例的蔗糖與麥芽糖存在時(shí)，愈傷組織的分化率和綠苗率都會(huì)有相應(yīng)的提高。本研究表明，在大麥成熟胚的組織培養(yǎng)中，也可能有相似的作用。

從相關(guān)性分析上可以看出，出愈率與分化率之間有較為密切的相關(guān)性，而與再生率以及綠苗率沒(méi)有相關(guān)性。分化率與再生率、綠苗率之間有明確的相關(guān)性。而且再生率與綠苗率之間的相關(guān)性更為密切。其中供試材料短芒紫青稞的出愈率僅為13.3%，但該品種的分化率為45.07%，再生率以及綠苗率分別為34%、32.15%。Morex的出愈率為94.95%，在所有供試品種中是最高的，但分化率以及再生率分別為80.75%和10.75%，呈現(xiàn)逐漸走低的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)大麥成熟胚愈傷的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵的作用，而分化培養(yǎng)基則對(duì)大麥再生有著一定影響。因此，可根據(jù)大麥不同的品種，設(shè)計(jì)相適應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基提高愈傷組織的出愈率，同時(shí)設(shè)計(jì)篩選合適的分化培養(yǎng)基，則可進(jìn)一步提高大麥的分化再生能力。

表9 相關(guān)性分析

注：**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

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