陳雪勤，周長艷，黃澤元

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

腌臘魚制品是我國傳統(tǒng)的風(fēng)味食品，有很廣闊的消費(fèi)市場［1］。傳統(tǒng)的發(fā)酵魚主要是通過自然發(fā)酵生成，其自然發(fā)酵是在較低的溫度和較高的食鹽濃度下進(jìn)行［2］，產(chǎn)品存在含鹽量高、脂肪氧化過度等質(zhì)量問題，產(chǎn)品的使用安全性低［3］，而且產(chǎn)品生產(chǎn)周期長，易受環(huán)境的影響，穩(wěn)定性得不到保證。利用微生物純化培養(yǎng)技術(shù)從傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品中分離純化得到有益微生物群體，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將有益微生物群體直接接種對魚進(jìn)行腌制發(fā)酵，可以有效地避免傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的不足，提高產(chǎn)品的安全性、風(fēng)味及感官質(zhì)量［4］。我們在前期實(shí)驗(yàn)中，從傳統(tǒng)發(fā)酵魚中分離純化得到優(yōu)勢乳酸菌［5］主要為干酪乳桿菌、香腸乳桿菌和乳酸乳桿菌［6］，并且得到混合菌種最佳配比(干酪乳桿菌∶香腸乳桿菌∶乳酸乳桿菌=1∶1∶1)。本實(shí)驗(yàn)采取直接投入的方式，通過單因素和正交試驗(yàn)以確定直投式復(fù)合菌劑生產(chǎn)發(fā)酵魚的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：干酪乳桿菌、香腸乳桿菌、乳酸乳桿菌，前期在實(shí)驗(yàn)室分離純化得到［6］。

培養(yǎng)基：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基［7］、MRS 培養(yǎng)基［7］。

草魚、花椒、食鹽、八角、桂皮、白糖、味精、生姜，購于武商量販超市(常青花園店)。

1.2 儀器

SF-400A電子天平、HR2864絞肉機(jī)、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)、VIS-7220可見分光光度計(jì)、SH045型恒溫恒濕培養(yǎng)箱、ZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、凱氏定氮儀、索氏提取儀、Vanox研究顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 花椒鹽的制作

稱取1000 g食鹽在鍋中翻炒至200℃后，加入50 g花椒、5 g八角、5 g桂皮，拌勻后離火繼續(xù)翻炒使溫度下降到50℃以下，然后加入200 g白糖、50 g味精和100 g生姜片，拌勻至冷卻后待用［8］。在腌制過程中按照鮮魚量加入1.41%花椒鹽作為腌制調(diào)料(其中含食鹽1%)。

1.3.2 工藝流程［9］

直投式復(fù)合菌劑生產(chǎn)發(fā)酵魚的生產(chǎn)工藝如圖1所示。

1.3.3 細(xì)菌活化及菌懸液的制備［10］

在無菌操作條件下，用接種環(huán)挑取前期分離出的菌種轉(zhuǎn)接到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，形成該菌株的液體培養(yǎng)物。取液體培養(yǎng)物l mL轉(zhuǎn)接到10 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，使菌種活化，形成菌懸液原液，并對菌懸液原液計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果對菌懸液原液用無菌水稀釋至1×109CFU/mL，再由高到低的順序依次稀釋，形成1×108CFU/mL，1×107CFU/mL，1×106CFU/mL，1×105CFU/mL菌懸液的應(yīng)用液，供備用。

圖1 直投式復(fù)合菌劑生產(chǎn)發(fā)酵魚的生產(chǎn)工藝

1.3.4 理化指標(biāo)的測定方法

(1)總酸度(%)的測定方法：按GB/T12456-2008 NaOH滴定法進(jìn)行測定。

(2)游離氨基酸含量(%)的測定：單指示劑甲醛滴定法。

(3)揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)(mg/100 g)的測定：采用微量擴(kuò)散法。

(4)總蛋白含量(%)的測定：按GB 5009.5-2010凱氏定氮法進(jìn)行測定。

(5)總脂肪含量(%)的測定：按GB/T5009.6-2003索氏提取法進(jìn)行測定。

(6)過氧化值(g/kg)的測定：按 GB/T 5538-2005方法進(jìn)行測定。

1.3.5 微生物指標(biāo)的測定方法

樣品中菌落總數(shù)的測定按照GB4789.2-2010進(jìn)行，乳酸菌的測定按照GB4789.35-2010進(jìn)行。

1.3.6 感官評定方法

由感官評定小組(由經(jīng)驗(yàn)豐富的10人組成)，按照參考文獻(xiàn)［11］的標(biāo)準(zhǔn)，分別從色澤、腥味、咸味、鮮味和硬度五個(gè)指標(biāo)對發(fā)酵魚制品進(jìn)行評定，每項(xiàng)指標(biāo)20分，每個(gè)指標(biāo)均分為4級(jí)，按照食品感官評價(jià)的要求打分，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［12］

1.3.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在自然發(fā)酵條件下，影響腌臘制品風(fēng)味的因素主要有食鹽含量、腌制溫度和腌制時(shí)間［13］。本實(shí)驗(yàn)主要考察復(fù)合菌劑接種量、食鹽含量、腌制溫度和腌制時(shí)間對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各指標(biāo)的大致范圍，在此基礎(chǔ)上，由優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析確定試驗(yàn)的最終方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)及其分析

2.1.1 復(fù)合菌劑接種量對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響

在食鹽含量7%及溫度10℃條件下腌制5 d。腌制結(jié)束后，考察復(fù)合菌劑(干酪乳桿菌∶香腸乳桿菌∶乳酸乳桿菌=1∶1∶1，由前期試驗(yàn)得到混合菌株的最佳配比)接種量對發(fā)酵魚總酸度、游離氨基酸、TVB-N、總蛋白含量、總脂肪含量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 接種量對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響

結(jié)果表明，隨著接種量的增大，發(fā)酵魚中總酸度、游離氨基酸、總蛋白、總脂肪含量逐漸上升，明顯高于自然發(fā)酵的空白對照組，而TVB-N含量逐漸下降，很明顯低于空白對照組。當(dāng)接種量達(dá)到106CFU/g時(shí)，試驗(yàn)組總酸含量、游離氨基酸含量、總蛋白含量、總脂肪含量增加很明顯，TVB-N值也有較大的下降趨勢。當(dāng)接種量大于108CFU/g時(shí)，這5個(gè)指標(biāo)變化均趨于平緩。因此，106—108CFU/g是比較適宜生產(chǎn)的接種量范圍。

2.1.2 食鹽含量和腌制時(shí)間對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響

在前期試驗(yàn)中，對分離出來的菌株做了耐鹽性的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)合菌劑在10%食鹽條件下仍具有活力。考慮到食鹽含量對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響，本試驗(yàn)選取3%—11%的梯度食鹽含量作為試驗(yàn)范圍［6］。在接種量106CFU/g、溫度10℃的條件下腌制?？疾觳煌雏}含量條件下發(fā)酵魚TVB-N值和過氧化值隨腌制時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖2，圖3所示。

圖2 食鹽含量和腌制時(shí)間對TVB-N的影響

由圖2可知，在相同時(shí)期，隨著食鹽用量的增大，發(fā)酵魚的TVB-N值呈減小趨勢，而隨著腌制時(shí)間的增加，各試驗(yàn)組的TVB-N值逐漸增大。在腌制1—2 d時(shí)，TVB-N值出現(xiàn)較大的增長，腌制天數(shù)大于2 d時(shí)，TVB-N值增長緩慢。當(dāng)添加3%食鹽時(shí)，TVB-N值明顯高于其它試驗(yàn)組，而食鹽含量在5%—11%時(shí)，發(fā)酵魚的TVB-N值相差很小。因此，發(fā)酵魚腌制過程中食鹽含量應(yīng)高于3%。

圖3 食鹽含量和腌制時(shí)間對過氧化值的影響

由圖3可知，發(fā)酵魚過氧化值隨著食鹽含量的增大而降低，但隨著腌制時(shí)間的增加而增大。3%，5%和7%食鹽含量的試驗(yàn)組腌制3 d后，過氧化值增至較高水平，此后變化趨于平穩(wěn)。9%和11%食鹽含量的試驗(yàn)組在整個(gè)腌制過程中，過氧化值均處于較低水平。因此，從樣品過氧化值的角度考慮，應(yīng)采用較高的含鹽含量。

綜合考慮以上試驗(yàn)指標(biāo)，當(dāng)食鹽含量大于3%，腌制時(shí)間不低于3 d時(shí)，可達(dá)到較好的腌制效果。食鹽含量、腌制時(shí)間繼續(xù)增大，各指標(biāo)的變化幅度較小?？紤]成本、產(chǎn)品風(fēng)味等因素，食鹽含量的大致范圍取為5%—7%，腌制時(shí)間為3—5 d。

2.1.3 腌制溫度和腌制時(shí)間對發(fā)酵魚品質(zhì)的影響

在接種量106CFU/g、食鹽含量7%的條件下腌制，考察不同溫度條件下發(fā)酵魚TVB-N、游離氨基酸、過氧化值、細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)隨腌制時(shí)間的變化情況，結(jié)果如圖4—圖7所示。

圖4 腌制溫度和腌制時(shí)間對TVB-N值的影響

由圖4可知，在相同時(shí)期，隨著腌制溫度的升高，發(fā)酵魚TVB-N值逐漸增大。20℃條件下發(fā)酵魚的TVB-N值明顯高于其它實(shí)驗(yàn)組。高溫條件加速了蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)的降解，因此為了保證發(fā)酵魚的品質(zhì)，應(yīng)選擇低溫條件下腌制。

圖5 腌制溫度和腌制時(shí)間對過氧化值的影響

由圖5可知，在相同時(shí)期，20℃試驗(yàn)組過氧化值明顯高于其它試驗(yàn)組。各實(shí)驗(yàn)組過氧化值均隨腌制時(shí)間的增加而增大，5℃，10℃條件下上升較為緩慢，在腌制3 d結(jié)束時(shí)，過氧化值變化趨于平緩。

圖6 腌制溫度和腌制時(shí)間對細(xì)菌總數(shù)的影響

圖7 腌制溫度和腌制時(shí)間對乳酸菌總數(shù)的影響

由圖6和圖7可知，不同腌制溫度條件下，細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢與乳酸菌總數(shù)的變化趨勢相同。隨著溫度的升高，細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)均呈上升趨勢。5℃和10℃條件下，細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)在整個(gè)腌制過程中都處于較低水平。隨著腌制時(shí)間的延長，各試驗(yàn)組細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌總數(shù)都逐漸增大，腌制3 d結(jié)束時(shí)，變化趨于平緩。從細(xì)菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)的變化情況可以看出，從腌制初期至腌制結(jié)束，乳酸菌均占很大比例，進(jìn)一步說明乳酸菌為發(fā)酵魚加工過程中的優(yōu)勢微生物。

綜合考慮以上指標(biāo)，腌制溫度應(yīng)低于20℃，結(jié)合成本、產(chǎn)品風(fēng)味及口感等，最適腌制溫度范圍取5—15℃，最佳腌制時(shí)間仍然是3—5 d。

2.2 直投式復(fù)合菌劑發(fā)酵魚的工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)確定的大致試驗(yàn)范圍基礎(chǔ)上，復(fù)合菌劑接種量、食鹽添加量、腌制溫度和腌制時(shí)間4因素各取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過感官評分確定最佳直投式發(fā)酵工藝，結(jié)果如表3所示。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析表

從表3正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果表明，各因素對感官評分影響的大小順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即接種量影響最大，其次為腌制溫度，然后是食鹽添加量，腌制時(shí)間影響最小。直投式復(fù)合菌劑發(fā)酵魚工藝條件的最佳組合為A1B2C2D2，即混合菌種接種量為106CFU/g，食鹽添加量為5%，腌制溫度為10℃，腌制時(shí)間為4 d。在此條件下感官評分為82.8。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗(yàn)所確定的直投式復(fù)合菌劑發(fā)酵魚的最優(yōu)工藝參數(shù)為混合菌種接種量為106CFU/g，食鹽添加量為5%，腌制溫度為10℃，腌制時(shí)間為4 d。該條件下生產(chǎn)出的發(fā)酵魚具有紅棕色光澤，質(zhì)地良好，保留了傳統(tǒng)發(fā)酵魚的香臘味，而且由于乳桿菌的作用，還具有柔和酸味，產(chǎn)品的TVBN值為18.72 mg/100 g，過氧化值為0.18 g/kg。與自然發(fā)酵過程相比，直投式復(fù)合菌劑發(fā)酵魚的時(shí)間比傳統(tǒng)的方法縮短了3 d，同時(shí)其TVB-N值和過氧化值分別降低了34.9%和51.6%(試驗(yàn)條件下測得傳統(tǒng)發(fā)酵魚的TVB-N值和過氧化值分別為28.74 mg/100g和0.372 g/kg)。該工藝對傳統(tǒng)發(fā)酵魚生產(chǎn)的改進(jìn)有一定參考意義。

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