趙麗娟 陳源紅 唐華英 韋紅玉 曾 怡

(右江民族醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西百色市 533000)

1型人類(lèi)免疫缺陷病毒tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建▲

趙麗娟 陳源紅 唐華英 韋紅玉 曾 怡*

(右江民族醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣西百色市 533000)

目的構(gòu)建人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表達(dá)載體。方法聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法從缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3中擴(kuò)增tat基因;將PCR獲得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表達(dá)載體分別用Hind III酶切;pSecTag2B載體片段經(jīng)小牛堿性磷酸酶去磷酸化后，用T4 DNA連接酶將tat基因與pSecTag2B載體片段連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行Hind III酶切鑒定，并利用Nco I酶切鑒定克隆的tat基因反向。最后選取正向tat基因克隆質(zhì)粒送基因測(cè)序。結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上約320bp位置出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的324bp大小一致;經(jīng)Hind III和Nco I分別酶切鑒定，獲得2個(gè)正向克隆;正向克隆經(jīng)測(cè)序，克隆的tat基因序列與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源。結(jié)論本研究方法可以成功地構(gòu)建HIV-1 tat基因分泌型真核表達(dá)載體。

人類(lèi)免疫缺陷病毒1型;tat基因;分泌型真核表達(dá)載體

人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)Tat蛋白是HIV-1的反式激活因子，有2個(gè)外顯子編碼。tat基因的第一個(gè)外顯子編碼為72個(gè)氨基酸，是Tat的反式激活活性區(qū);第二個(gè)外顯子編碼為T(mén)at蛋白的羧基端，包含一個(gè)RGD基序，是Tat蛋白與受體αvβ3和α5β1整合素結(jié)合的部位。Tat蛋白是HIV-1病毒復(fù)制所必需的反式激活因子，已有研究證實(shí)Tat蛋白與HIV-1 RNA 5'端啟動(dòng)子上的反式激活反應(yīng)元件(trans-activation responsive element，TAR)結(jié)合［1］，激活 HIV-1 長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminate repeat，LTR)，使其下游的基因得以表達(dá)，從而促進(jìn)整個(gè)HIV-1轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。Tat蛋白本身沒(méi)有分泌信號(hào)，但是當(dāng)T細(xì)胞急性感染HIV-1而細(xì)胞尚未死亡或通透性尚未改變時(shí)，Tat蛋白可被釋放到細(xì)胞外間質(zhì)，并可能作用于其他細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)感染的其他病毒，發(fā)揮細(xì)胞轉(zhuǎn)化或激活病毒復(fù)制周期的作用。本研究旨在構(gòu)建HIV-1 tat基因重組的分泌型真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究分泌型Tat蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、DNA模板 PCR擴(kuò)增所用的模板為缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3，由南京醫(yī)科大學(xué)盧春教授饋贈(zèng)。分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 試劑與儀器 根據(jù)GenBank中登記的HIV-1 tat基因設(shè)計(jì)PCR引物，并在PCR上、下游引物的5'端引入Hind III酶切位點(diǎn)，在上游引物5'端起始密碼子ATG前添加了一個(gè)KOZAK序列(GCCACC)以增強(qiáng)基因的表達(dá)。PCR引物序列(下劃線(xiàn)部分為Hind III酶切位點(diǎn)):P1 5'-AAG CTT GCC ACC ATG GAG CCA G-3'，P2 5'-AA G CTT CTA ATC GAA TGG ATC TG-3';預(yù)期片段大小為324bp。PCR引物均由上海捷倍思生物工程公司合成。Lammda DNA EcoR I+Hind III分子量標(biāo)記、PCR所用試劑Taq DNA多聚酶及緩沖液、dNTP、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、小牛堿性磷酸酶購(gòu)自Fermentas公司，100bp ladder DNA分子量標(biāo)記為大連寶生物產(chǎn)品，感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京天根生化科技公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司。研究中主要使用下列儀器:1-15PK冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma)，Mycycler PCR 儀(美國(guó) Bio-Rad)，Chemidoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 tat基因的擴(kuò)增及純化 取1 μL pNL4-3做模板，用PCR引物P1和P2，PCR擴(kuò)增HIV-1 tat基因，PCR反應(yīng)體系包括:引物P1 10pmoL;P2 10 pmoL;10×Taq DNA聚合酶緩沖液 5 μL;MgCl22.5 mmol/L;dNTPs 每 種2.5 mmol/L;Taq DNA聚合酶 2單位;總反應(yīng)體積50 μL擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 5 min;按94℃ 1 min，59℃ 30 s，72℃1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀(guān)察確認(rèn)擴(kuò)增成功。平衡酚:氯仿法純化剩余的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體的構(gòu)建 分別取1 μg PCR 產(chǎn)物和1 μg pSecTag2B，經(jīng) Hind III酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收DNA片段。T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布含100 μg/mL氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的 LB 平板，37℃培養(yǎng)16～18 h。挑取4個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆至含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃、250 rpm/min振蕩培養(yǎng)16～18 h。提取質(zhì)粒，Hind III酶切初步鑒定。

1.2.3 tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體中tat基因插入方向的鑒定及基因測(cè)序 經(jīng)Hind III酶切初步鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒，進(jìn)一步用Nco I酶切進(jìn)行重組的tat基因插入方向的鑒定。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀(guān)察

經(jīng)酶切鑒定的正向克隆質(zhì)粒送公司進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 HIV-1 tat基因的擴(kuò)增及純化 以pNL4-3質(zhì)粒為模板，用引入限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增并用1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約320bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期的324bp大小基本一致。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增HIV-1 tat基因

2.2 限制性酶切初步鑒定tat重組分泌型真核表達(dá)載體從4個(gè)細(xì)菌克隆提取的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶Hind III酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳后，共有3個(gè)克隆在約320bp和約5200bp位置出現(xiàn)條帶，另有1個(gè)克隆未見(jiàn)目的基因條帶。電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 tat重組分泌型真核表達(dá)載體的酶切鑒定

2.3 tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體中tat基因插入方向的鑒定及基因測(cè)序 在分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B中610nt、903nt、2110nt、2330nt位置共有 4 個(gè) Nco I酶切位點(diǎn)，tat基因序列有1個(gè)Nco I酶切位點(diǎn)，如果pSecTag2B中正向插入 tat基因，經(jīng) Nco I酶切后可出現(xiàn) 108bp、220bp、293bp、1433bp、3439bp共5個(gè)DNA片段;如果tat基因是反向插入pSecTag2B 中，經(jīng) Nco I酶切后可出現(xiàn) 221bp、294bp、441bp、1121bp、3439bp共5個(gè)DNA片段。結(jié)果顯示，泳道2，3為正向克隆，泳道1為反向克隆。泳道2，3的正向克隆質(zhì)粒送公司測(cè)序，結(jié)果顯示正向克隆的 tat基因序列與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源。

圖3 Nco I酶切鑒定重組分泌型真核表達(dá)載體中tat基因的插入方向

3 討論

在HIV-1感染的過(guò)程中，正常的宿主細(xì)胞始終暴露在游離的HIV-1病毒顆粒以及不斷在體內(nèi)循環(huán)的HIV-1編碼蛋白中。雖然這些正常細(xì)胞不會(huì)被HIV直接感染，但是與HIV-1相關(guān)的蛋白接觸會(huì)對(duì)他們的基因表達(dá)以及正常功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。除了糖蛋白120(glycoprotein 120 gp120)，可溶性的HIV-1 Tat也由感染細(xì)胞分泌并且可以和靶細(xì)胞表面的 αvβ3 以及 α5β1 整合素結(jié)合［2，3］。該結(jié)合過(guò)程依賴(lài)于Tat蛋白羧基端的高度保守序列精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸(RGD)，RGD與細(xì)胞表面受體的結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的活化，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞基因表達(dá)的改變此外，細(xì)胞外Tat可與細(xì)胞膜非特異性結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞［2，4］。細(xì)胞內(nèi)化的Tat蛋白可直接與細(xì)胞基因作用而改變基因表達(dá)。

在美國(guó)，有超過(guò)20%的AIDS患者同時(shí)患有卡波濟(jì)肉瘤(Kaposi's sarcoma，KS)，這類(lèi)KS稱(chēng)為 AIDS-KS。多項(xiàng)研究表明KSHV的感染與KS的發(fā)生密切相關(guān)，而HIV-1感染者更容易發(fā)生KS。本課題組先前的研究證實(shí)［5，6］，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Tat蛋白可激活潛伏的KSHV的復(fù)制周期，并促進(jìn)Kaposin蛋白介導(dǎo)的類(lèi) KS腫瘤形成。探討 Tat蛋白在AIDS-KS發(fā)生機(jī)制中的作用，對(duì)研究AIDS-KS的預(yù)防和治療方法有重要意義。

本研究采用PCR法從缺失pol基因的重組HIV-1基因組pNL4-3中擴(kuò)增tat全基因，利用Hind III單酶切并克隆入分泌型真核表達(dá)載體pSecTag2B中，進(jìn)一步用Nco I對(duì)插入的tat基因進(jìn)行插入方向的鑒定后，最后進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genbank中登記的HIV-1 tat基因100%同源，表明我們獲得了正向插入的tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體。由于我們未購(gòu)買(mǎi)到抗Tat蛋白抗體，因此未能利用Western blot(WB)法進(jìn)行Tat蛋白表達(dá)的檢測(cè)。在下一步的研究中，本項(xiàng)目組將采用基因轉(zhuǎn)染、WB、CAT-LTR ELISA的方法，將tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，檢測(cè)構(gòu)建的重組載體中tat基因在293細(xì)胞中表達(dá)的Tat蛋白，并進(jìn)一步檢測(cè)表達(dá)的Tat蛋白的反式激活活性Tat蛋白分泌情況，最終驗(yàn)證本研究構(gòu)建的tat基因重組分泌型真核表達(dá)載體。該載體最終鑒定后可用于研究分泌型Tat蛋白在激活KSHV復(fù)制周期和促進(jìn)AIDS-KS發(fā)生發(fā)展中的作用。

［1］ Barillari B，Ensoli B.Angiogenic effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 tat protein and its role in the pathogenesis of AIDS-associated Kaposi's sarcoma［J］.Clinical Microbiology Reviews，2002，15(2):17.

［2］ Barillari G，Gerdelman R，Gallo KC，et al.The Tat protein of human immunodeficiency virus type 1，a growth factor for AIDS Kaposi sarcoma and cytokine-activated vascular cells，induces adhesion of the same cell types by using integrin receptors recognizing the RGD amino acid sequence［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(17):7941－7945.

［3］ Ensoli B，Barillari G，Salahuddin SI，et al.Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi＇s sarcoma lesions of AIDS patients［J］.Nature，1990，345(6270):84 －86.

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Construction of secretory eukaryotic vector of tat gene from human immunodeficiency type 1

ZHAO Li-Juan，CHEN Yuan-Hong，TANG Hua-Ying，WEI Hong-Yu，ZENG Yi(Department of Microbiology and Immunology of Youjiang Medical University For Nationalities，Baise 533000，China)

ObjectiveTo construct secretory eukaryotic expression vector of tat gene from human immunodeficiency type 1(HIV-1).MethodsHIV-1 tat gene was amplified from pNL4 －3 plasmid，which was HIV-1 genome deleted pol gene，with polymerase chain reaction(PCR).Tat DNA fragments and secretory eukaryotic expression vector，pSecTag2B were then digested with Hind III.Digested pSecTag2B fragments were further dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase(CIP).Digested tat DNA fragments and pSecTag2B fragments were ligated overnight with T4 DNA ligase and were further transformed to E.coli competent cells DH5α.Furthermore，recombinant plasmids were extracted and determined by digestion with Hind III restricted enzyme.Moreover，the direction of inserted tat gene in recombinant plasmids was detected with Nco I restricted enzyme.Consequently，plasmids from norientation clone were sequenced.ResultsA band about 320bp as expecting(324bp)was visible when PCR products were electrophoresis in 1%agarose.Digested with Hind III and Nco I enzyme respectively，2 positive norientation clone were determined.Thesequence of tat gene cloned in norientation plasmid was 100%homology with HIV-1 tat gene registered in GenBank.ConclusionHIV-1 tat gene can be cloned into secretory eukaryotic vector successfully.

Human immunodeficiency virus type 1;Tat gene;Secretory eukaryotic expression vector

R 349.83

A

1673-6575(2012)04-0347-04

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(桂科自0728246，桂科青0728105)，廣西教育廳項(xiàng)目(桂教科研［2006］26號(hào)200610LX123);右江民族醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目(右醫(yī)科字［2007］2號(hào));廣西百色市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃課題(百科計(jì)字［2006］13號(hào))

趙麗娟(1967～)，女，碩士，副教授，研究方向:分子病毒學(xué)。

*通訊作者

2012-03-06

2012-04-28)