朱格非 麥 慧* 張 馳 傅麗清 滕曉顰

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，南寧市 530021;2新西蘭奧克蘭大學化學科學學院，奧克蘭市 1142)

丙烯酰胺單體對人肝細胞作用的實驗研究▲

朱格非1麥 慧1*張 馳2傅麗清1滕曉顰1

(1廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，南寧市 530021;2新西蘭奧克蘭大學化學科學學院，奧克蘭市 1142)

目的探討丙烯酰胺單體(acrylamide，AA)對體外培養(yǎng)人肝細胞株(L-02)的生長抑制作用。方法MTT比色法測定不同時間段、不同濃度AA對L-02細胞的生長抑制率，并設對照組，繪制生長抑制曲線。結果經不同濃度(0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%)的 AA作用24 h、48 h、72 h后，與對照組比較，L-02生長抑制率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AA對L-02細胞均有明顯毒性，表現(xiàn)為細胞增殖抑制作用。結論AA對體外培養(yǎng)的L-02細胞具有增殖抑制作用，且呈時間劑量依賴性。

丙烯酰胺;肝細胞;細胞毒性;MTT法

聚丙烯酰胺水凝膠被證實無毒性［1］，曾被整形美容醫(yī)師大量應用于注射隆乳，但用于注射隆乳后，仍出現(xiàn)大量術后并發(fā)癥，如感染、局部疼痛等［2～5］，眾多學者對注射隆乳后并發(fā)癥的原因進行了廣泛的探討和研究。以往的動物實驗證實丙烯酰胺單體具有腎毒性，但尚未見其在細胞學水平對肝毒性的相關研究報道。為此本研究以人肝細胞株L-02作為工具細胞，丙烯酰胺單體作用后，MTT比色法檢測其對L-02細胞是否具有增殖抑制作用。

1 材料和方法

1.1 受試材料 丙烯酰胺單體(acrylamide，AA MW 71.08，瑞興科技有限公司)。細胞株:人正常肝細胞株(L-02)(中國醫(yī)學科學院上海細胞庫)。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學制品公司)，小牛血清(Gibco公司)，磷酸緩沖鹽PBS(索萊寶公司)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，索萊寶公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，胰蛋白酶(博士德公司)。儀器設備:倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scien)，超凈工作臺(上海力申科學儀器公司)，電子分析天平(蘇州四海醫(yī)療器械有限公司)，氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)，全自動酶標分析儀(山東高密彩虹分析儀器公司)。

1.2 藥物配制 分析天平精確稱量AA，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，配制成50%溶液常溫避光備用。

1.3 細胞培養(yǎng) L-02細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、濕度95%條件下靜置培養(yǎng)。細胞生長到80%后，加入1 mL消化液(含0.02%EDTA，0.25%胰蛋白酶)消化，待細胞變圓，間隙增大時，棄消化液，注入培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成單細胞懸液，1/3比例傳代，每3～4 d傳代一次。

1.4 AA對L-02細胞的毒性作用 采用MTT比色法，取對數生長期的L-02細胞經0.25%胰蛋白酶消化、吹打分散后計數，配制為細胞密度為8×104/mL的細胞懸液，每孔100 uL接種于96孔板中，分別設置24 h、48 h、72 h培養(yǎng)板。每板分別設有不同劑量藥物組、陰性對照組、空白組，每組3個復孔。細胞貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，將AA溶液加入相應各孔，終濃度分別為0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%。藥物作用細胞 24 h、48 h、72 h 后，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT10 μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結晶充分溶解，酶標儀測每孔光密度(optical density，OD)值，波長490 nm，按以下公式計算抑制率:

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行處理，實驗數據以±s表示，各組間的比較采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

不用劑量AA作用24 h、48 h、72 h后，對體外培養(yǎng)的L-02均有抑制作用，隨著AA濃度的增加，細胞OD值逐步降低，表示細胞受到明顯的抑制和破壞。其抑制率呈現(xiàn)明顯劑量依賴關系，隨著藥物劑量增大，其對細胞的生長抑制越強。經統(tǒng)計學分析，藥物作用24 h、48 h、72 h時，不同濃度AA對L-02的生長抑制與陰性對照組OD值的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而藥物作用48 h后，AA在濃度為0.625%時，較24 h對L-02生長抑制率增加，但組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。藥物作用72 h后，AA在各濃度對L-02的生長抑制率均高于90%。見表1、圖1。

表1 AA 24 h、48 h、72 h對L-02細胞的生長抑制效應 (±s，n=3)

表1 AA 24 h、48 h、72 h對L-02細胞的生長抑制效應 (±s，n=3)

注:各組生長抑制率與陰性對照組比較:*P ＜0.05，#P ＜0.01。

藥物濃度V(%)(μmol/L)24 h OD值 抑制率(%)48 h OD值 抑制率(%)72 h OD值 抑制率(%)0.625(0.012) 0.245 ±0.024 60.65%* 0.125 ±0.015 78.75%# 0.078 ±0.015 93.87%#1.25(0.023) 0.204 ±0.027 67.24%* 0.089 ±0.016 84.83%# 0.074 ±0.060 94.13%#2.5(0.046) 0.146 ±0.044 76.50%# 0.075 ±0.023 87.16%# 0.067 ±0.062 94.71%#5(0.093) 0.131 ±0.052 78.96%# 0.080 ±0.009 86.31%# 0.072 ±0.064 94.34%#10(0.185) 0.113 ±0.076 81.91%# 0.093 ±0.004 84.09%# 0.085 ±0.067 93.26%#20(0.370) 0.062 ±0.144 90.10%# 0.057 ±0.010 90.34%# 0.066 ±0.005 94.81%#陰性對照組0.623 ±0.052 － 0.587 ±0.046 － 1.266 ±0.069 －

圖1 不同時間段AA對L-02細胞的生長抑制率

3 討論

醫(yī)用填充材料置入人體后，需同體液相接觸，聚丙烯酰胺水凝膠(polyacrylamide hydrogel，PAAG)作為高聚合材料，已被廣泛證實對人體無明顯毒性。國內外多位學者的研究報道認為，PAAG是無毒、無過敏、無致畸、無胚胎毒性、無突變和無降解的，注射入人體后形態(tài)自然［6，7］。1997年該產品引入中國后，開始大量應用于注射隆胸或其他軟組織填充，2000年開始出現(xiàn)多個案例的術后并發(fā)癥的報道，主要為急性或無菌性炎癥、疼痛、局部腫脹、紅腫、穿破或竇道形成等，且注射物易于向組織間隙滲漏。2006年4月30日國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)文全面停止了生產、銷售和使用PAAG(注射用)。

目前聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳后產生術后并發(fā)癥的原因尚未完全清楚。聚丙烯酰胺是無毒的，但其單體并不能完全聚合，殘留的AA是有毒的，由此可以推斷聚丙烯酰胺這類聚合物是否有毒，以及毒性程度，應取決于AA的殘留量。因此國內外眾多學者將目光聚焦于人體內單體殘留量，大量文獻報道對注射治療后的患者進行體內單體檢測，亦未得出明確結論［8］。

通過本次試驗發(fā)現(xiàn)，AA對人正常肝細胞具有明顯的生長抑制作用。藥物作用24 h、濃度為0.625%的AA對L-02細胞的生長抑制率即達到了60.65%，濃度為20%的AA的細胞生長抑制率達到68.75%，與對照組的差異具有顯著統(tǒng)計學意義。藥物作用48 h、濃度為0.625%的AA對細胞的生長抑制率達到78.75%，與對照組的OD值差異具有統(tǒng)計學意義，20%的藥物濃度細胞生長抑制率達90.34%。藥物作用72 h、0.625%的藥物濃度細胞生長抑制率為93.87%，20%的藥物濃度細胞生長抑制率達94.81%。AA對L-02細胞的生長抑制率呈現(xiàn)了明顯的時間劑量正相關，隨著藥物劑量增大、藥物作用時間延長，其對細胞的生長抑制作用越強，具有明顯的細胞毒性。

由此可見，醫(yī)用聚合物材料置入人體內后，同體液相接觸，該聚合物本身沒有毒性，引起炎癥和組織反應的主要原因是聚合物中的易溶出物質，這些易溶出物質一般包括殘留的原料單體及該高聚物內的其他添加劑等等［9］。本研究通過細胞毒性試驗證實了AA對L-02具有明顯的毒性作用，但也只能反映出PAAG溶出物的毒性情況，但要定量地考察出聚合物溶出物對生物的影響則是比較困難的。國內有學者對聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳患者的注射物中進行丙烯酰胺單體提取，AA提取量均明顯小于未植入體內的聚丙烯酰胺水凝膠中單體最低檢出量［10］。也就是說在注射人體內后，AA在注射區(qū)域的含量明顯小于未植入人體前的檢出量。此類結果無明顯實際意義，因為聚丙烯酰胺水凝膠中的水分在人體組織復雜的生物環(huán)境中與體液進行交換，且AA具有水溶性，其可以自由擴散，被組織吸收、代謝使之含量減少，對注射部位AA含量的檢測尚不能代表AA對人體的毒性強弱，因此這需要了解注射隆乳的患者術后一定時間內血液中單體的含量，并對血液中的AA含量的檢測方法進行探索，并分析這些濃度的溶出物是否會對人體造成毒性反應。AA進入體內后，廣泛分布于體液，并可以通過母體進入胎兒體內，其在人體內會產生一系列代謝反應。體內的丙烯酰胺主要與谷胱甘肽結合，反應生成N-醋酸基-S-半胱氨酸，通過其他生物轉化途徑產生N-甲基丙烯酰胺和N-異丙基丙烯酰胺，最后從尿液中大量排出，丙烯酰胺及其代謝產物可以與血紅蛋白結合，能聚集在神經系統(tǒng)、肝、腎及生殖系統(tǒng)［11］。

綜上所述，我們需要建立大樣本大型哺乳動物模型，在動物模型身上進行模擬手術，注射一定劑量聚丙烯酰胺水凝膠，喂養(yǎng)一定時間后分不同時間段抽取血液進行AA的檢測，了解AA在動物體內含量變化并進行分析，這將是今后研究的重點。

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Study on anti-proliferation effect of acrylamide on human hepatocyte in vitro

ZHU Ge-fei1，MAI Hui1* ，ZHANG Chi2，F(xiàn)U Li-qing1，TENG Xiao-pin1(1.Department of Plastic Surgery，The People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，Guangxi，China;2.School of Chemical Science，the University of Auckland，Auckland 1142，New Zealand)

ObjectiveTo explore the growth-inhibition effect of acrylamide(AA)on human hepatocyte L-02 in vitro.Method Method The growth-inhibition rate of L-02 of different concentration of AA in different time section were tested by MTT method，with L-02 cultured with medium free of AA as control group.Anti-proliferation curves were drawn.Result The anti-proliferation rate of L-02 of different concentration of AA(0.625，1.25，2.5，5，10，20%)in different time section(24h，48h，72h)was different to that of the control(P ＜0.05).AA was showed with apparent cytotoxicity of cytostasis.ConclusionAA has a function of anti-proliferation on L-02 in vitro，and it increases with both time and dose.

Acrylamide;Human hepatocyte;Cytotoxicity;MTT method

R 318.08

A

1673-6575(2012)06-0584-04

廣西科學基金(編號:桂科自0991210)

朱格非(1981～)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:軟組織修復與重建。*

2012-10-11

2012-11-16)